martes, 5 de abril de 2016

Inmunología

moléculas de superficie de las células T

 INTRODUCCIÓN

En este capítulo nos vamos a centrar en las proteínas de superficie de los linfocitos T que están implicadas de una forma u otra en la detección de antígenos y en la transmisión de la señal al interior de dicha célula, haciendo especial hincapié en el receptor clonotípico (específico).
El receptor clonotípico para antígeno de las células T (TCR) ha tardado más tiempo en ser conocido, debido a que, a diferencia de las inmunoglobulinas, no existe versión secretada, sino que siempre va unido a membrana. Otro factor que ha dificultado el estudio de su funcionalidad es que aunque el TCR tiene especificidad antigénica, reconoce al antígeno de modo restringido por el haplotipo MHC propio.
A partir de los años 80, debido al empleo de las modernas técnicas de anticuerpos monoclonales y de clonación molecular del ADN se pudieron aislar los genes que codifican las cadenas del TCR. Se ha visto que su organización genómica y su modo de generar diversidad son muy parecidos a los de los genes de las inmunoglobulinas.
El receptor de los linfocitos T se presenta como heterodímeros, que pueden ser de dos tipos:
el TCR-2 está compuesto por una cadena a y otra b
el TCR-1 está compuesto por una cadena g y otra d .
En ambos casos, el TCR está asociado a un complejo de proteínas de membrana, denominado CD3 que es el encargado de transducir la señal al interior celular.

10.2   ESTRUCTURA DEL TCR

Aún no se han logrado análisis cristalográficos por rayos X del TCR completo (aunque sí de la cadena b), por lo que sólo podemos "sospechar" su estructura en función de la secuencia de aminoácidos y su parecido con las inmunoglobulinas.

10.2.1   El TCR-2 (a b )

Está formado por dos cadenas polipeptídicas distintas, asociadas con cadenas polisacarídicas. Cada polipéptido posee dos dominios globulares de tipo inmunoglobulina (es decir, unos 110 aminoácidos cada dominio, con el característico bucle de Ig formado por la unión por puentes disulfuro de dos cisteínas separadas 60-70 aminoácidos):
cadena a : tiene unos 49 kDa de peso molecular. Consta de un dominio amino-terminal variable (Va ), un dominio proximal constante (Ca ), un segmento transmembranal de unos 20 aminoácidos, con abundantes cargas positivas, y una cola citoplásmica en el extremo carboxi-terminal.
cadena b (43 kDa): dominio amino-terminal distal, variable (Vb ), dominio proximal constante (Cb ), segmento transmembranal cargado positivamente, de unos 20 aminoácidos, y cola citoplásmica en el extremo carboxi-terminal.
Las dos cadenas están unidas entres sí por puentes disulfuro, en una secuencia cercana a la membrana. Una característica notable de las dos cadenas es que sus respectivos segmentos transmembranales contienen aminoácidos cargados positivamente. Ya veremos que aunque en principio ello debería conllevar la inestabilización de la unión entre a y b, esto no ocurre debido a que dichas cargas están contrarrestadas por las cargas negativas de las cadenas asociadas del CD3.
En cada dominio variable (Va , Vb ) existen tres regiones hipervariables que también reciben el nombre (como en el caso de las Ig) de regiones determinantes de complementariedad (CDR).
El TCR se parece, pues, a un brazo Fab de anticuerpo que estuviera unido a membrana, si bien diferencias entre las respectivas zonas de transición entre los dominios V y C sugieren que el TCR es una estructura más rígida.

10.2.2  El TCR-1 (g d )

Es parecido al TCR-2, aunque se han detectado varias formas diferentes, algunas unidas intercaternariamente por puentes disulfuro, y otras no.
En humanos, las células T dotadas de TCR de tipo g d son poco abundantes en circulación, pero en cambio son las predominantes en el epitelio intestinal. En el ratón se encuentran células g d en la piel (no así en humanos), en útero y en la lengua.

10.3 ORGANIZACIÓN Y REORDENACIÓN DE LOS GENES DEL TCR

10.3.1 Organización en línea germinal de los genes del TCR

Al igual que con las inmunoglobulinas, los TCR están codificados a partir de la reordenación de segmentos génicos de tipo V, D, J y C.
Existen cuatro familias multigénicas: una para a , una para b , una para g y otra para d , estando esta última "dentro" de la familia a . Las familias de a y g poseen segmentos V, J y C, mientras que las familias de b y d poseen V, D, J y C.
En los mapas genéticos se puede ver que los segmentos de la familia d están dentro de la zona a ("rompiéndola en dos"), entre Va y Ja . Esto implica que una reordenación productiva de cadenas a deja fuera toda la región d ; es decir, que las reordenaciones de cadenas a y d son mutuamente excluyentes en la misma célula.
En humanos existen unos 70-80 genes Va, 61 genes de Ja y un solo gene Ca . Para las cadenas b existen 52 genes V, tras los cuales existen dos bloques D-J-C: el primero comienza con el segmento Db1, al que se asocian 6 segmentos J y el segmento Cb1. El segundo bloque comienza con Db2, sigue con 7 segmentos J y acaba con el Cb2.
Se puede deducir que en el pasado evolutivo ocurrió una duplicación de un bloque original D-J-C. Esta duplicación en tándem de Db , Jb y Cb debió de ocurrir al comienzo de la evolución de los mamíferos, ya que la comparten especies actuales separadas filogenéticamente (como ratón y humanos).
Como se puede ver, en comparación con los genes de inmunoglobulinas hay mayor cantidad de segmentos de tipo J, lo cual tiene importantes consecuencias para el reconocimiento del antígeno por parte de los linfocitos T.

10.3.2  Reordenaciones de segmentos de regiones variables

Su base es similar a la ya tratada en inmunoglobulinas: cada segmento está limitado por una (en el caso de V y J) o dos (en D) secuencia(s) RSS consistente en una sucesión de heptámero-espaciador-nonámero, idéntico al de los segmentos génicos de Ig, y las reordenaciones se guían por la "regla" que dice que una RSS de una vuelta se empareja con una RSS de dos vueltas.
Las células pre-T del timo expresan los genes RAG1, RAG2, así como la TdT (desoxinucleotidil transferasa terminal), todas ellos implicados en estas reordenaciones.
Al igual que en las Ig, existe un orden para las reordenaciones: primero se reorganizan los segmentos de cadenas b, y posteriormente lo hacen los de las cadenas a.

10.3.3 Exclusión alélica

Existe exclusión alélica estricta para las reordenaciones de las cadenas b . Pero para cadenas a parece que no se da una exclusión alélica: de vez en cuando se pueden expresar simultáneamente los dos alelos de a en la misma célula T.

10.3.4 Rescate de reordenaciones improductivas

Los genes de las cadenas del TCR tienen una propiedad en su reordenación que no aparece (o aparece raramente) en el caso de los genes de Ig: Si la reordenación de uno de los dos alelos de un tipo de cadena no resulta productiva, se intentan nuevas reordenaciones del mismo alelo.
Recuérdese que en el caso de los genes de cadena b hay en línea germinal dos bloques distintos D-J-C. Esto permite que se puedan intentar varias reordenaciones sucesivas, y eleva la probabilidad de lograr una productiva al 80% (frente al 50% de los genes de Ig).
En el caso de las cadenas a, hay que considerar la abundancia de segmentos J en línea germinal. Ello permite que se intente una tras otra varias reordenaciones en el mismo alelo (o sea, en el mismo cromosoma), hasta agotar los segmentos disponibles. De esta forma se aumenta igualmente la probabilidad de obtener reordenaciones productivas para esta cadena. Pero aún más, puede ocurrir que debido a que para cadenas a no hay exclusión alélica, una misma célula produzca dos tipos de cadenas a, una por cada alelo (cromosoma).

10.3.5 Estructura de los genes reordenados del TCR

Los segmentos fusionados V+J o V+D+J codifican los respectivos dominios variables de la cadena a y b .
Los genes C constan de un conjunto de exones e intrones:
primer exón determina el dominio globular de tipo Ig (Ca o Cb )
primer intrón
segundo exón (H) determina el segmento conector que hay desde el domino globular hasta la parte de membrana
segundo intrón
tercer exón ( Tm) determina el segmento transmembrana
tercer intrón
cuarto exón (ct) codifica la cola citoplásmica.

10.3.6  Producción de diversidad de los TCR

Ciertas peculiaridades de los genes y de las reordenaciones hacen que la diversidad del receptor de las células T sea aún mayor que en el caso de las Ig.

10.2.6.1  Unión aleatoria entre V, (D) y J

Veamos unos cálculos teóricos (para el caso del ratón) sobre la diversidad que existe potencialmente solamente por el hecho de que los segmentos V (D) y J se pueden unir aleatoriamente:
para cadenas a :100 Va x 50 Ja = 5·103 combinaciones
para cadenas b :25 Vb x 2 Db x 12 Jb = 6·102 combinaciones
total combinaciones aleatorias de a con b = 3·106 combinaciones.
Como vemos, una cantidad ya respetable, pero a ella hay que añadir el efecto de otros mecanismos suministradores de variedad, incluido uno que no existe en el caso de la variedad de inmunoglobulinas:

10.3.6.2 Unión alternativa de segmentos D

Este mecanismo no interviene en las inmunoglobulinas, pero sí en el TCR. Para entender este mecanismo basta observar que los segmentos D del TCR están limitados por una RSS de una vuelta y otra RSS de dos vueltas (en lugar de dos RSS de dos vueltas como tienen los segmentos D de las inmunoglobulinas). Esto permite que en el caso de las cadenas b y d se puedan unir dos o más segmentos D, ocurriendo estas varios tipos de uniones adicionales:
unión directa entre V y J (sin intervención de D)
unión V+D+J (lo normal en el caso de las Ig)
unión V+D+D+J (es decir, dos segmentos D)
(en humanos) V+D+D+D+J (tres segmentos D)

10.3.6.3 Flexibilidad de unión

Se produce como lo ya visto para las Ig: al producirse el empalme entre segmentos, se puede dar un "recorte" de algunos nucleótidos en los extremos originales, y posterior empalme aleatorio escogiendo entre varios de los nucleótidos de cada zona terminal. Esto origina, como es lógico, muchas reordenaciones no productivas, pero a cambio aumenta la diversidad por las cadenas productivas nuevas, al producir aminoácidos alternativos en las zonas de empalme V-J, V-D y D-J.
Pero aún más, se ha visto que en el caso del TCR los segmentos D se pueden leer en las tres fases de lectura posibles, lo que supone otro factor potenciador de la diversidad, ya que aumentan las posibilidades de lecturas productivas.

10.3.6.4 Adición de N-nucleótidos y P-nucleótidos (horquilla P)

Este mecanismo se debe a la acción de la desoxinucleotidil-transferasa terminal (TdT). Pero mientras que en el caso de las Ig afectaba sólo a los genes de las cadenas pesadas, en el de las TCR la adición de nucleótidos aleatorios sin molde genético ocurre en los cuatro tipos de cadenas (a ,b , g , d ).
En cada zona de juntura entre segmentos se puede añadir una media de 6 nucleótidos al azar, lo que produce en cada caso 5.461 permutaciones posibles. Teniendo en cuenta las posibilidades entre segmentos que hemos visto en el apartado 10.3.5.2 los cálculos de las nuevas combinaciones posibles de cadenas son:
para V+J:5.461 = 5.5·103
para V+D+J(5.461)2 = 3.3·107
para V+D+D+J(5.461)3 = 1.6·1011
Los números que resultan de combinar las posibilidades de los diferentes mecanismos generadores de diversidad son inimaginables:
combinando el efecto de los N-nucleótidos con el de la flexibilidad de unión, resultan 10 billones (1013) de posibilidades
combinando todas las posibilidades para a b obtenemos 1015 posibilidades distitintas de receptores TCR2
combinando todas las posibilidades para g d resulta la inimaginable cantidad de 1018 combinaciones de TCR1.
( ¡… y eso que no hemos incluido en este cómputo el efecto de que los segmentos D se pueden leer en las tres fases!).
Se ha calculado que aún suponiendo que sólo el 1% de estas combinaciones fueran viables, todavía resultarían unos 1022 tipos de receptores TCR. Suponiendo ahora que aún así, el 99% de éstos fueran seleccionados negativamente en el timo, nos quedaría la descomunal cifra de unos 1019. Pero el ratón sólo produce unos 109 linfocitos. Esto plantea una pregunta aún sin respuesta: ¿los linfocitos T reales suponen un subpoblación aleatoria de la gigantesca "población virtual" teóricamente posible, o sus TCR están "seleccionados" de alguna manera?
Lo que no aparece en el caso de las TCR es el mecanismo de mutación somática, pero ello tiene un sentido biológico adaptativo: una vez que un TCR ha sido seleccionado en el timo, al no poder cambiar ya más, se reduce la posibilidad de que en el supuesto cambio surjan células T autorreactivas que pudieran a atacar al propio individuo.

10.4 EL COMPLEJO RECEPTOR TCR-CD3

El TCR se asocia no covalentemente a una serie de proteínas que constituyen el marcador de células T conocido como CD3, y que está implicado en la transducción de señal al interior del linfocito T.
El CD3 es un complejo de cinco tipos de cadenas polipeptídicas invariantes, que se asocian de dos en dos, formando tres clases de dímeros:
heterodímero g e
heterodímero d e
homodímero x x (a veces sustituido por el heterodímero x h o el homodímero h h ).
Así pues, el complejo TCR-CD3 se puede considerar formado por cuatro tipos de dímeros:
el heterodímero TCR clonotípico (a b o g d ), que es el que reconoce el péptido procesado junto con el MHC
tres tipos de dímeros invariantes del CD3, que se requieren para:
  1. La expresión adecuada del TCR (se necesitan para que TCR llegue a la membrana citoplásmica).
  2. Estabilizar al TCR: las cargas negativas de la porción transmembranal de cadenas del CD3 equilibran las cargas positivas de las cadenas del TCR, estabilizando el complejo.
  3. Para la transducción intracelular de la señal que supone la unión TCR-péptido-MHC.
Las cadenas g , d y e del CD3 pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, y cada una de ellas posee un solo dominio extracelular globular de tipo Ig estabilizado por un puente disulfuro. A ello sigue un segmento transmembrana con carga neta negativa, y finalmente un dominio citoplásmico de unos 40 aminoácidos.
Estas tres cadenas están codificadas por sendos genes, muy parecidos en su secuencia, y que están estrechamente ligados. Estos genes a su vez parecen "parientes" de los que codifican las cadenas Iga e Igb que acompañan siempre a la Ig de membrana.
Las cadenas x y h son distintas a las anteriores; poseen un segmento extracelular muy corto (sólo 9 aminoácidos), una región transmembrana con carga neta negativa y una cola citoplásmica larga (de 113 aa. en el caso de x y de 155 aa. en el caso de h ).
Las cadenas x y h están codificadas por el mismo gen, que en cada caso sufre un proceso de empalme diferencial del ARN, que afecta al extremo 3’.
Todos los péptidos de CD3 tienen en común un mismo tipo de secuencia en sus colas citoplásmicas, que se denomina motivo ARAM (iniciales inglesas de "motivo de activación tras reconocimiento de antígeno". Recientemente se va imponiendo la denominación de ITAM, que significa motivo de inmunorreceptor activable por tirosina). Las cadenas g , d y e tienen un solo motivo ARAM, mientras que las x y h cuentan con tres. En el próximo capítulo veremos la implicación de tales secuencias en la transducción de señal; baste decir aquí que el ARAM contiene ciertas tirosinas que son susceptibles de ser fosforiladas por determinadas proteínquinasas tras la estimulación del receptor clonotípico TCR.

10.5  MOLÉCULAS DE MEMBRANA ACCESORIAS

Aparte del complejo formado por el TCR y el CD3 que cumple un papel central en la unión con el antígeno procesado, la célula T madura cuenta con varias moléculas accesorias de membrana, con funciones de
adhesión a la célula presentadora de antígeno o a la célula diana, reforzando la interacción;
(varias de ellas) transducción de señales desde el TCR al citoplasma.
  1. CD4: es una glucoproteína monomérica de unos 55 kDa, con 4 dominios extracelulares de tipo Ig (D1, D2, D3 Y D4), región transmembrana y larga cola citoplásmica en la que existen tres serinas fosforilables. Cumple funciones de adhesión y co-señalización: se une al dominio proximal b 2 del MHC-II de las células presentadoras de antígeno. Su presencia suele conferir al linfocito T papeles de célula coadyuvante (TH).
  2. CD8: Suele ser un heterodímero a b donde las dos cadenas están unidas por puente disulfuro. Cada cadena tiene de 30 a 38 kDa y un solo dominio extracelular de tipo Ig, una región transmembrana y cola citoplásmica de 25 a 27 aminoácidos, varios de ellos susceptibles de ser fosforilados. Cumple papeles de adhesión y co-señalización al unirse al dominio a 3 de la MHC-I de las células diana. Su existencia en los linfocitos suele caracterizar a las células T matadoras (citotóxicas, TC).
    3. En su papel como moléculas de adhesión, las CD4 y CD8 incrementan unas 100 veces la avidez de la interacción entre el TCR y el complejo {péptido-MHC}.
    En su papel como correceptores (co-señalizadores) se piensa que actúan detectando el cambio del TCR cuando se une al complejo péptido:MHC, y facilitando una señal al interior celular, a través de sus dominios citoplásmicos, que están asociados a Lck, una proteín-quinasa de tirosina.
  3. CD2: se une a LFA-3 (también conocida como CD58).
  4. LFA-1 (=CD11a/CD18): se une a ICAM-1
  5. CD45R: se une a CD22
  6. CD28 (de TH) se une a la molécula B7 de la célula presentadora de antígeno, suministrando una segunda señal que se requiere para la activación del linfocito T coadyuvante (véase el tema 11).

10.6   INTERACCIÓN TCR-ANTÍGENO

Aún sabemos poco "en directo" sobre cómo es la interacción ternaria entre el TCR, el péptido procesado y el MHC (ello se debe en buena parte a la falta de datos de difracción de rayos X del TCR de membrana).
Por sí mismo, el TCR tiene una Kd hacia {péptido-MHC} de sólo 4 a 6·10-5M (frente a 10-7 a 10-11M para la interacción Ac-Ag). Ello sugiere que aunque la interacción específica depende del TCR, el aumento de la afinidad que realmente se observa se debe al papel de moléculas accesorias y de adhesión.
Se piensa que en principio, el primer contacto entre la célula T y la célula presentadora o célula diana se produce por moléculas de adhesión mutuamente interactuantes, y entonces el TCR del linfocito T puede "rastrear" la superficie de la membrana de la célula que tiene enfrente en busca de complejos específicos {péptido-MHC}. A su vez, cuando se ha efectuado el contacto ternario TCR-péptido-MHC se induce un incremento transitorio en las moléculas de adhesión (CD2, LFA-1) que permite un contacto más estrecho y más prolongado, durante el cual la célula T ejecuta su papel (liberar ciertas citoquinas en el caso de la TH y excretar sustancias citolíticas en el de la TC). Finalmente, la célula T se desliga de la célula presentadora o de la célula diana.
Aunque no existen datos de cristalografía de rayos X del TCR, parece que éste debe tener parecido a un brazo de Fab de Ig que estuviera unido a la membrana, de modo que los dominios variables exteriores deben estar formando una estructura globular de tipo Ig, con las regiones CDR (hipervariables) formando bucles hacia el exterior.

Modelo hipotético de interacción TCR-péptido-MHC:

De los tres CDR de cada cadena del TCR, los dos primeros (CDR1 y CDR2) son menos variables que el CDR3:
Recuérdese que la enorme diversidad generada por la flexibilidad de unión, lectura en las tres fases posibles y por la adición de N-nucleótidos afecta al CDR3.
En cambio, las CDR1 y CDR2 derivan directamente de las secuencias V de línea germinal que cada linfocito haya elegido para la reordenación.
Se sospecha, pues, que CDR1 y CDR2 deben contactar con MHC, probablemente interactuando con las dos hélices en a, y CDR3 debe hacerlo con la porción hidrófila de los péptidos. Es decir, la variabilidad del TCR complementa la variabilidad del complejo MHC-péptido.
Se ha propuesto la siguiente nomenclatura: la parte del TCR que interacciona con el péptido, por analogía con la de la Ig, se llamaría paratopo (y según el modelo anterior, residiría sobre todo en la zona de CDR3); las porciones de TCR que se ligan al MHC se llamarían histotopos.

En cuanto al MHC, el sitio de unión al antígeno (que algunos llaman desetopo) reside, como vimos, en el surco que queda entre las dos a -hélices.
El péptido (que como estudiamos, suele ser anfipático), mostraría su lado hidrófobo (el agretopo) al surco del MHC, mientras que por su porción hidrófila (epitopo) se uniría con el paratopo del TCR.
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