Inmunología

maduración y activación - diferenciación de los linfocitos T

INTRODUCCIÓN

El receptor clonotípico de las células T (TCR) presenta dos funciones principales según la fase de desarrollo en que se encuentre la célula dentro del linaje de los linfocitos T:

1. Durante la maduración de los timocitos en el timo, participa en la selección tímica positiva y negativa.
2. Una vez que el linfocito T ha madurado, emigra a la periferia, y entonces el receptor participa en el reconocimiento de antígenos, lo que desencadena un programa de activación que lleva a la proliferación y diferenciación de las células T en dos subclones: uno de células efectoras, y otro de células de memoria.

El proceso de reconocimiento varía según que hablemos de TCR-2 (a b ) o del TCR-1 (g d ): en el primer caso, y como ya hemos visto, se reconocen péptidos en el contexto del haplotipo propio del MHC clásico, y se requieren moléculas coestimuladoras y coseñalizadoras, notablemente la CD4 (para linfocitos T_H) o la CD8 (para los linfocitos T_C); en el caso del g d , no se requiere MHC clásico, y no participan CD4 ni CD8.

Refiriéndonos a los linfocitos con receptores de tipo a b , podemos hacer un avance resumido de estos procesos de maduración y activación:

Maduración: la enorme diversidad antigénica potencial se reduce a un 2% durante la maduración intratímica de los timocitos: sólo llegan a madurar aquellas células restringidas a reconocer lo no-propio en el contexto del haplotipo MHC propio (autorrestricción y autotolerancia). Las fases finales de la maduración ocurren por dos rutas de desarrollo diferentes que generan dos subpoblaciones: linfocitos CD4+(restringidos por MHC-II) y linfocitos CD8+ (restringidos por MHC-I).

Activación: La activación de células T maduras periféricas se inicia con la interacción entre el TCR y un péptido antigénico enclavado en la hendidura del MHC. Como ya comentamos, la baja afinidad (10-5M) de esta interacción ternaria se ve potenciada por la presencia de correceptores y otras moléculas de membrana, que funcionan para fortalecer la interacción ternaria TCR-péptido-MHC, y para transducir la señal activadora al interior de la célula T. Ello desencadena la proliferación clonal y diferenciación en dos subpoblaciones, una de T efectoras y otra de T de memoria.

11.2 MADURACIÓN DE LAS CÉLULAS T

Desarrollo del timo:

El estroma tímico surge al inicio del desarrollo embrionario a partir de capas ectodérmicas y endodérmicas procedentes del tercer bolsillo faríngeo y de la tercera hendidura branquial. Estas dos estructuras se invaginan, y se cierran, y las dos capas quedan superpuestas, de modo que la ectodérmica rodea a la endodérmica, formando el llamado rudimento tímico.

	La capa ectodérmica formará los tejidos epiteliales corticales del timo;
	La capa endodérmica formará los tejidos epiteliales medulares.

El rudimento tímico atrae entonces a células de origen hematopoyético, que lo colonizan: células dendríticas, macrófagos y precursores de timocitos.

Al nacer, los humanos tienen ya plenamente desarrollado el timo.

	En su corteza encontramos sólo timocitos en fases tempranas de su maduración, junto con algunos macrófagos, dentro del estroma cortical a base de células corticales epiteliales.
	En la médula encontramos timocitos en fases más avanzadas de maduración con células dendríticas y macrófagos, todos inmersos en un estroma medular a base de células epiteliales medulares.

Los ratones, al nacer, aún no han terminado de formar el timo adulto.

En el ratón, las células progenitoras abandonan la médula ósea y llegan al timo hacia el día undécimo de gestación (en humanos esto ocurre en las semanas 8ª y 9ª), atraídas por factores quimiotácticos producidos por las células epiteliales tímicas. Entonces comienza la ruta ontogenética que conducirá a la formación de linfocitos T maduros. Al igual que para la maduración de los linfocitos B, aquí veremos cómo aparecen (o desaparecen) de modo ordenado ciertas moléculas marcadoras de superficie (CD) del linaje de los linfocitos T, y aludiremos a los momentos en los que se producen los fenómenos de reordenación de segmentos genéticos ya estudiados en el capítulo anterior.

11.2.1   Rutas de desarrollo en el linaje de las células T

El primer marcador de superficie en aparecer (en ratón) es el Thy-1 (equivalente al CD2 de humanos), que ya no se pierde (por lo tanto, se trata de un marcador que caracteriza al linaje de T). Estas células Thy-1⁺ CD4^- CD8^- (dobles negativas) pueden escoger dos vías alternativas:

1. En una de las dos rutas, las células hacen reordenaciones productivas de g y d y expresan CD3 en su membrana. Suponen sólo <1 14="" a="" al="" aparecer:="" d="" de="" desaparecen="" detectan="" en="" gestaci="" las="" li="" los="" n="" nacimiento.="" pero="" primeras="" se="" son="" timocitos.="">
2. La mayoría escoge una vía alternativa, que discurre de la siguiente manera:

día 16º: Las células reordenan genes de cadenas b. Si no se logran reordenaciones productivas, entran en apoptosis. Si la reordenación es productiva, la cadena b se asocia con la llamada cadena a sustitutiva (una especie de "pseudo-a", o cadena a de pre-T, que se abrevia pTa), generando el receptor pTa:b(junto con CD3). Este receptor induce la proliferación celular y la coexpresión de CD4 y CD8: de este modo aparecen los timocitos grandes doble positivos. El receptor pTa:b también induce la reordenación de genes de cadenas a.

Día 17º: CD4+ CD8+ TCR-2+ (a b ) CD3+. Se trata de los pequeños timocitos dobles positivos, que dejan de dividirse. Estas células ya provistas del complejo receptor específico van a ser sometidas, hasta la época del nacimiento (en que alcanzan sus máximos niveles), a selección positiva y negativa:

	selección positiva: sobreviven aquellas células que tengan TCR capaces de reconocer MHC-I o MHC-II de células epiteliales del timo. Con ello se garantiza la restricción por propio haplotipo de las células T.
	selección negativa: de aquellas células que han pasado la selección positiva mueren por apoptosis las que posean TCR que reconozcan con alta afinidad péptidos propios enclavados en el MHC o MHC propio solo. Ello tiende a garantizar la propiedad de autotolerancia por eliminación de los linfocitos T autorreactivos.

 Los timocitos dobles positivos que superan la doble selección tímica se desarrollan en una de dos posibles rutas alternativas:

	CD4+ CD8- TCR-2+ CD3+ (representan el 10% de timocitos)
	CD8+ CD4- TCR-2+ CD3+ (un 5% de los timocitos)
	adicionalmente, y quizá procedente de los anteriores, al 5º día del nacimiento se detecta una tercera subpoblación de CD4- CD8- TCR+ CD3+.

Estas poblaciones abandonan el timo como linfocitos T maduros (inmunocompetentes) vírgenes, y circulan por la periferia, pudiéndose establecer en órganos linfoides secundarios (ganglios) y recirculando continuamente entre sangre y linfa, a la espera de que en uno de sus asentamientos en ganglios llegue a encontrar su antígeno; si no lo encuentra, muere al cabo de unas 5 a 7 semanas.

Localización intratímica de las diversas fases madurativas:

	Los timocitos doble negativos se localizan en la zona subcapsular de la corteza.
	Los pequeños timocitos dobles positivos se localizan en la corteza.
	Los timocitos maduros CD4+ y CD8+ se ubican en la médula.
	En la corteza, las células epiteliales corticales establecen contactos por sus largos procesos de membrana con los timocitos.

11.2.2. Selección tímica positiva y negativa

En ambos procesos selectivos parecen jugar un papel importante las células del estroma tímico: células epiteliales tímicas, macrófagos y células dendríticas; todas ellas expresan en sus membranas grandes niveles de moléculas MHC-I y/o MHC-II. Los timocitos inmaduros dobles positivos (CD4⁺ CD8⁺ TCR⁺ CD3⁺) interaccionan, por mecanismos aún oscuros, con estas células estromales, lo que conduce a la selección positiva y negativa.

En la selección positiva se da interacción de los timocitos con células epiteliales corticales del timo (Las células corticales epiteliales van provistas de largos procesos de membrana que permiten contactos simultáneos con varios timocitos). Algunos autores han sugerido la interacción de los timocitos inmaduros dobles positivos con dichas células epiteliales por medio del TCR restringido por MHC podría conllevar algún tipo de señal protectora que librara a estos timocitos de la muerte celular programada; en cambio, la apoptosis afectaría a los timocitos no restringidos por MHC propio.

De los timocitos que sobreviven a la selección positiva algunos llevan TCR de baja afinidad hacia auto-péptidos presentados por MHC, y otros llevan TCR con alta afinidad hacia auto-péptidos presentados por ese MHC: estos últimos sufren selección negativa, que ocurre en la zona de transición cortico-medular y en la médula tímica, y en la que las células dendríticas y los macrófagos interaccionan con los timocitos portadores de TCR de alta afinidad hacia {autopéptidos-MHC} o hacia MHC solo.

Los auto-péptidos que inducen la selección negativa son aquellos derivados de proteínas expresadas en el mismo timo, así como aquellos procedentes de proteínas ubicuas que llegan al timo por la circulación.

Así pues, la autotolerancia se consigue eliminando células T (en realidad sus precursores inmaduros, timocitos) autorreactivas, y permitiendo el desarrollo de las específicas que reconocen péptidos extraños (no-propios) enclavados en el MHC propio (una combinación que alguien ha denominado como "lo propio alterado").

La selección positiva también regula otros dos fenómenos en los que no nos vamos a detener:

	Regulación de reordenaciones de cadenas a: la expresión en membrana del TCR no es suficiente para desconectar los genes de RAG y de TdT, de modo que continúa la reordenación de segmentos génicos de cadenas a, pudiéndose dar el caso de que una misma célula pueda tener dos tipos de TCR que tienen en común sus cadenas b, pero que difieren en las cadenas a, si bien sólo uno de ellos será funcional.
	La selección positiva también regula la expresión del correceptor (CD4 o CD8) en las células maduras (es decir, el hecho de que dejan de ser doble positivas para convertirse en CD4+ o CD8+). Ello depende a su vez de la especificidad del TCR por la clase de MHC (I o II). El mecanismo de esta retención selectiva de sólo uno de los correceptores es aún objeto de investigación y debate.

11.3   ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T COADYUVANTES

La activación y expansión clonal de T_H es un acontecimiento central en la producción de las respuestas inmunes específicas (tanto la humoral como la celular). Se trata de un proceso complejo que en los últimos años está siendo paulatinamente desentrañado. Antes de entrar en detalles, podemos resumirlo para tener una idea general:

	los linfocitos T vírgenes son células en reposo que se encuentran "aparcadas" en la fase G0 del ciclo celular. La activación, proliferación y diferenciación de estas células es un fenómeno complejo.
	La activación se inicia cuando el linfocito TH interacciona, a través de su complejo TCR-CD3, con el antígeno peptídico (exógeno) -procedente de procesamiento endosómico- enclavado en el surco de MHC-II de una célula presentadora. En esta interacción inicial, y en la señal que se va a producir, participan, además, moléculas accesorias, como el correceptor CD4.
	Esta interacción inicial "dispara" una compleja cascada de acontecimientos bioquímicos, en la que son esenciales actividades quinasas y fosfatasas, y que culminan con la activación y expresión de diversos genes, entre los que se cuentan el de la IL-2 y el de su receptor.
	La secreción autocrina de IL-2 por parte de los linfocitos TH hace que éstos salgan de la fase G0 y entren y progresen en el ciclo celular: ello provoca la proliferación y diferenciación de la célula T en dos subpoblaciones: una de células efectoras (las T coadyuvantes o colaboradoras) y las TH de memoria.
	Pero para que ocurra esto se requieren, además señales coestimulatorias. Si tales señales químicas no se suministran al tiempo en que se está produciendo la interacción específica TCR-péptido-MHC, se induce un estado de incapacidad de respuesta inmune que se denomina anergia, que se manifiesta en tolerancia inmunológica hacia el estímulo antigénico.

11.3.1 Rutas de señalización intracelular

El TCR tiene colas citoplásmicas cortas que por sí mismas son incapaces de señalización intracelular. Una vez que dicho TCR se une al péptido:MHC, esta señal se transduce al interior de la célula T por medio de los dominios citoplásmicos de CD3, el correceptor CD4 y varias moléculas accesorias (CD2, CD45). Dicha transducción de señal se realiza por medio de una serie de proteín-quinasas y proteín-fosfatasas. Antes de pasar a ver las rutas bioquímicas de transducción de señal, haremos una breve descripción de algunas de estas enzimas implicadas.

11.3.1.1  Algunas enzimas de la ruta de señalización

11.3.1.1.1   Proteín-quinasas de la familia del protooncogén src

1) Proteína p56^lck

	Se trata de una proteín-quinasa que se une a membrana mediante ácido mirístico engarzado a la glicocola en posición 2 (Gly2).
	Posee dos secuencias homólogas con otras proteínas (SH2 y SH3).
	La SH2 participará en el reconocimiento de tirosinas fosforilables en la proteína diana.
	La porción carboxiterminal es la que tiene actividad de quinasa. Obsérvese la existencia de dos tirosinas (representadas por Y): la que está en la posición 394 (denominada de regulación positiva) es la tirosina que se fosforila al activarse el linfocito T, mientras que la que está en posición 505 (llamada Tyr de regulación negativa) está fosforilada (Tyr-P) en las células T en reposo, y se desfosforila cuando las células se activan.
	En el primer tercio se encuentra una cisteína que será la encargada de unirse por puente disulfuro con CD4 (o en el caso de TC, con CD8). También se asocia físicamente con las cadenas x y e del CD3.

2) Proteína p59 ^fyn

	Su estructura es muy parecida a la de p56lck. También se encuentra anclada a la membrana por miristilación.
	Igualmente posee una Tyr cerca del extremo carboxi-terminal, que cuando está fosforilada hace que la p59fyn esté inactiva, y otro sitio Tyr capaz de recibir fosfato por autofosforilación de esta quinasa, lo cual hace que la proteína pueda fosforilar a otras proteínas.
	Está físicamente asociada a cadenas x del CD3.

11.3.1.1.2   Fosforilasa ZAP-70

	No está asociada por miristilación a la membrana.
	Contiene una Tyr capaz de autofosforilarse, pero a diferencia de las proteínas de la familia src, carece de Tyr de regulación negativa.
	En las células T en reposo, la ZAP-70 no se encuentra asociada al complejo TCR-CD3; sin embargo, cuando se inicia el proceso de activación celular, y una vez que las cadenas x y e de CD3 quedan fosforiladas por otras proteín-quinasas, la ZAP-70, por medio de sus dominios SH2 se une a estas cadenas fosforiladas, y entonces queda activada en su capacidad de fosforilasa.

11.3.1.1.3    Fosfatasa CD45 (=LCA=T200)

	El CD45 es en realidad una familia de fosfatasas específicas de tirosina, que aparecen en todas las células del linaje hematopoyético excepto en los eritrocitos.
	Existen varias isoformas, de entre 180-200 kDa, que proceden de procesamiento alternativo de un mismo tipo de ARN, y cada una de ellas aparece en determinados tipos celulares. Por ejemplo, CD45RA aparece en T vírgenes mientras que CD45R0 en T cebados.
	Tiene un dominio extracelular, que está glucosilado; se une a la CD22.
	Su porción citoplásmica es larga, y cuenta con dos dominios dotados de actividad fosfatasa de tirosinas (PTP).
	Parece ser que una de sus funciones es desfosforilar la Tyr-P situada cerca del extremo carboxi-terminal de las proteín-quinasas (PTK) p56lck y p59fyn.

11.3.1.2 Modelo actual de la activación del linfocito T_H

	La señalización a través del complejo TCR-CD3 requiere que se agreguen muchos complejos junto con sus correspondientes correceptores CD4, y con CD45. Los numerosos conjuntos TCR-CD3-CD4 interaccionan simultáneamente con muchos complejos péptido:MHC-II de la célula presentadora de Ag (se requieren al menos unos 100 de tales complejos). Cada TCR se une al péptido antigénico enclavado en el MHC-II de la célula presentadora de antígeno. Al mismo tiempo, el CD4 interacciona (por su dominio extracelular) con el dominio b 2 de la MHC-II. Esta interacción parece que provoca un cambio conformacional que se transmite a las colas citoplásmicas de los polipéptidos del CD3 y del CD4. Ello induce la yuxtaposición de p56lck con las secuencias ARAM (=ITAM) de las proteínas de CD3.
	Entonces, la actividad fosfatasa de CD45 provoca la desfosforilación de la tirosina fosforilada (Tyr-P) carboxi-terminal de p56lck y de p59fyn, lo que supone la activación de estas dos proteín-tirosínquinasas (PTK): se autofosforilan en la otra tirosina (la de regulación positiva).
	La activación de las dos PTK citadas por autofosforilación provoca que a su vez éstas fosforilen las cadenas del complejo CD3, reconociendo las secuencias ARAM en x y en e . También se fosforila la cola
	A las colas fosforiladas de CD3 y CD4 se une ahora la ZAP-70, de modo que ésta adquiere a su vez su actividad de proteínquinasa, con lo que puede fosforilar a cadenas del CD3 y a otras proteínas.
	La ZAP-70 activa y la Fyn activa fosforilan a la fosfolipasa Cg 1 (PLCg 1), que originalmente es una proteína citoplásmica; al fosforilarse la PLCg1 se activa y emigra al lado citoplásmico de la membrana, reconociendo otras proteínas que tienen tirosinas fosforiladas. Al hacer esto, se facilita que la PLCg 1 entre en contacto con su sustrato: el fosfatidil-inositol-bifosfato (PIP2).
	Entonces, la PLCg 1 hidroliza a este PIP2, generando inositol-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG), cada uno de los cuales suponen el arranque de sendas rutas dentro de esta compleja cascada activadora:

A) Ruta del inositol-trifosfato (IP₃):

1. El IP₃ se une a un receptor específico situado en el REr, provocando la salida al citoplasma de grandes cantidades de Ca⁺⁺, y junto con IP₄ provoca también la entrada desde el exterior celular, a través de canales de calcio de la membrana citoplásmica, de más cantidades de este catión.
2. El aumento intracelular de Ca⁺⁺ estimula a la enzima calmodulina, que es una serín/treonín-quinasa.
3. La calmodulina activada activa a su vez a la calcineurina, que es una fosfatasa.
4. La calcineurina activada cataliza la desfosforilación del factor NF-AT citoplásmico fosforilado (NF-ATc-P).
5. Una vez desfosforilado, el NF-AT emigra al núcleo, donde se junta con el factor nuclear AP1, formando entrambos un factor de activación transcripcional de varios genes, entre ellos el que codifica la citoquina IL-2.

Aparte de esta secuencia de acontecimientos, los altos niveles citosólicos de Ca⁺⁺ pueden estimular igualmente a la proteín-quinasa C (PKC) y la quinasa MAP-II.

B) Ruta del diacilglicerol (DAG):

1. El DAG estimula, junto con el Ca⁺⁺, a la proteín-quinasa C (PKC), que hasta ese momento residía en el citoplasma.
2. Al activarse, la PKC emigra a la cara interna de la membrana citoplásmica; allí, en presencia de los fosfolípidos, ejerce su función como serín/treonín-quinasa:

fosforila una amplia variedad de proteínas, entre las cuales se encuentra la codificada por el protooncogén ras. La proteína Ras a su vez inicia otra cascada de fosforilaciones que llega hasta las quinasas MAP. Estas quinasas parece que emigran al núcleo, donde activan por fosforilación a factores de transcripción:

c-fos y c-jun se unen para formar el ya citado AP1, que se une solo o junto con NF-AT, reconociendo en cada caso secuencias específicas de la zona promotora/intensificadora de ciertos genes.

otra de las consecuencias de la actividad PKC es que se fosforila el componente inhibidor del factor NF-k B que estaba retenido en el citoplasma.Al fosforilarse, el componente inhibidor queda a merced de unas proteasas, que lo degradan. Es entonces cuando el NF-k B puede emigrar al núcleo y unirse a secuencias específicas del promotor del gen de IL-2 y de otros genes.

11.3.2   La señal coestimulatoria

Además de las señales suministradas a partir del contacto entre el complejo TCR-CD3 con el péptido-MHC, la activación del linfocito T_H requiere una señal adicional, denominada coestimulatoria, que puede consistir en alguna de las siguientes:

	la citoquina IL-1, suministrada por la célula presentadora de antígeno (APC),
	la citoquina IL-6, de la APC,
	pero la señal más potente es la que supone el contacto entre la molécula B7 (=CD80) de la célula presentadora y la CD28 o la CTLA-4 del linfocito TH.

B7 (=CD80) consta de dos cadenas idénticas con dos dominios de tipo Ig. Se expresa exclusivamente en células presentadoras de antígeno capaces de estimular a linfocitos T. Se puede presentar en dos versiones estructuralmente parecidas, denominadas B7.1 y B7.2.

La CD28 es una glucoproteína homodimérica, cuyo monómero pesa 44 kDa, presente en linfocitos T_H en reposo. Cada cadena presenta un dominio de tipo V-Ig, y está muy glucosilada. Tiene afinidad baja hacia la B7.

La CTLA-4 está codificada por un gen cercano al de la CD28, presentando ambas grandes homologías. Pero la CTLA-4 sólo se expresa en linfocitos T_H activados, siendo su afinidad muy alta hacia la molécula B7. Parece que interviene en las interacciones entre T_H y B (a estudiar más adelante, en el tema 12).

La interacción entre CD28 y B7 ejerce un efecto sinérgico sobre la señal transmitida desde el complejo TCR-CD3, de modo que aumenta la producción de IL-2 y la proliferación de linfocitos T coadyuvantes.

Parece que la vía coestimulatoria se basa en la activación de proteín-tirosín-quinasas que activan a la PLCg 1, de modo que se potencia la ruta calmodulina/calcineurina. Por otro lado, las PTK activan un factor de transcripción (CD28R) que mejora los niveles de transcripción de IL-2 y prolonga la vida media de su ARNm.

11.3.3   Activación génica

Resumiendo la idea central emanada del apartado anterior, podemos decir que tras la interacción del linfocito T_H con el péptido enclavado en el surco de MHC-II de una célula presentadora de antígeno, se pone en marcha unas rutas que conducen a la activación de una serie de genes.

Pues bien, los genes que se activan se pueden clasificar según el momento relativo de su expresión, en tres categorías:

1. Genes de expresión inmediata (una media hora). Estrictamente hablando, estos genes no se activan, sino sus productos ya preformados.
2. Genes de expresión temprana (1 a 2 horas): son esencialmente los que codifican las citoquinas IL-2 (así como el gen de su receptor IL-2R), IL-3, IL-6 e interferón gamma (IFN-g ).
3. Genes de expresión tardía (hasta 2 días o más): los que codifican ciertas moléculas de adhesión intercelular.

Para que se produzca la expansión clonal de los linfocitos T_H se necesita un incremento en la expresión del gen de la interleuquina 2 (IL-2) y de su receptor (IL-2R). En esta tarea interviene una serie de proteínas reguladoras y factores de transcripción que se unen a secuencias específicas de la zona 5’ no codificadora (promotor/intensificador) de los correspondientes genes:

	complejo AP1 (c-Fos+c-Jun): se une al elemento TRE
	factor nuclear NF-AT
	factor {AP1+NF-AT}, que es específico de las células T: se une al elemento ARRES
	complejo Oct-1+Oct-2+OAP: se une a OBM
	factor NF-kB: se une a la secuencia kB-RE.

La forma fosforilada (citoplásmica) de NF-AT, al activarse el linfocito T, se desfosforila por la acción de la calcineurina, con lo que se activa y emigra al núcleo; allí forma complejo con AP1, reconociendo una secuencia específica (denominada ARRES) del promotor de los genes de IL-2 y de IL-2R.

Esta desfosforilación del NF-AT se puede inhibir por la acción de drogas como la ciclosporina A (Cs-A) o el FK506:

La Cs-A forma complejo con la inmunofilina del individuo, y dicho complejo bloquea la acción desfosforiladora de la calcineurina hacia el factor NF-ATc-P. Ello provoca el bloqueo de la activación de los linfocitos T_H, con lo que disminuye la intensidad de la respuesta inmune.

Por esta razón estos fármacos se emplean para la inmunosupresión de enfermos trasplantados o con injerto.

11.4   ANERGIA CLONAL

La unión de un linfocito T_H con un complejo péptido-MHC II de una célula presentadora de antígeno puede conducir a dos tipos de respuestas opuestas:

	activación y expansión clonal
	anergia clonal

La anergia clonal es la incapacidad proliferativa de un linfocito tras un contacto con el complejo péptido-MHC, y se debe a la carencia de la señal coestimulatoria proporcionada por la interacción entre CD28 del linfocito T_H y B7 de la APC. No se trata de una mera no-respuesta pasiva, sino que la anergia es un estado activo de no proliferación. Para ilustrar estas ideas, nos remitimos a unos experimentos:

1. Si ponemos en contacto linfocitos T_H con APC fijadas por glutaraldehido (y que por lo tanto no expresan moléculas B7 en su membrana), el linfocito entra en anergia. Esto se debe a que aunque ha contactado por su complejo TCR-CD3 con el péptido-MHC (señal #1), la APC no le ha suministrado la señal coestimultoria (señal #2), con lo que el T_H produce poca IL-2.
2. Para confirmar que la anergia es un estado activo, tomemos el linfocito hecho anérgico en el experimento 1) y mezclémoslo con APC normales: pues bien, a pesar de que ahora en principio están disponibles las moléculas implicadas en la señal #2, el linfocito T_H sigue sin capacidad de respuesta. Es decir, una vez que un linfocito ha sido hecho anérgico, ese estado se mantiene a pesar de que a posteriori se le suministre la señal coestimuladora.
3. Para demostrar que la señal #2 (coestimulatoria) es distinta de la señal #1, se puede realizar el siguiente experimento: tomamos linfocitos normales, y los ponemos simultáneamente en contacto con una APC fijada por glutaraldehido y con una APC alogénica (de distinto haplotipo MHC) normal (no fijada). El resultado ahora es que el linfocito se activa de modo normal. Esto se debe a que la APC fijada le suministra la señal #1 específica (dependiente de interacción TCR-péptido-MHC) aunque no la señal #2; pero dicha señal coestimulatoria se la suministra la APC alogénica, que posee su B7.

El requerimiento simultáneo de ambas señales implica que sólo las APC profesionales pueden iniciar las respuestas inmunes dependientes de células T. Ello es importante para evitar la autoinmunidad. Como se recordará, no todos los clones de T potencialmente autorreactivos son eliminados durante la maduración tímica. Los clones que "escapan" podrían en principio reconocer auto-péptidos en cualquier célula propia (señal #1), y luego interaccionar con una APC, que les suministraría la señal coestimulatoria (señal #2), con lo que se activarían, iniciando una peligrosa reacción de autoinmunidad. Pero como hemos visto, la realidad es que para que un linfocito T virgen sea activado, se le deben suministrar las dos señales al mismo tiempo y en la misma célula, y este criterio sólo lo cumplen esas células presentadoras profesionales. De esta manera, se evita la autoinmunidad, y de hecho, si la célula T reconoce un autopéptido en ausencia de la señal de B7 entra en anergia, con lo ese clon será autotolerante.

11.5    POBLACIONES PERIFÉRICAS DE CÉLULAS T MADURAS

11.5.1  Células T a b

Un 90-95% de las células T periféricas son de tipo a b (o sea, TCR-2), existiendo una proporción de CD4⁺ doble que las CD8⁺. En general, las CD4⁺ funcionan como células T coadyuvantes (T_H) y las CD8⁺ lo hacen como T citotóxicas (T_C), aunque parece que ambas poblaciones expresan el mismo repertorio de segmentos variables (Va y Vb ).

La población circulante (periférica) de células T consiste en T vírgenes, T efectoras y T memoria.

11.5.1.1    Linfocitos T vírgenes: resumen de su ciclo de vida y de su activación hasta células efectoras

Las células T CD4⁺ y T CD8⁺ vírgenes inmunocompetentes que acaban de madurar abandonan el timo y entran en circulación en un estado de reposo (G₀ del ciclo celular). Se caracterizan por:

	bajos niveles de moléculas de adhesión
	altos niveles del receptor de alojamiento (homing) llamado L-selectina, que les permite unirse a la dirigina (addressin) vascular de las vénulas de endotelio alto (HEV) de los ganglios linfáticos. Esto permite la extravasación del linfocito virgen hasta el interior del ganglio a partir de la circulación.
	Expresan la isoforma de alto peso molecular de CD45 (llamada CD45RA), implicada en la transducción de la señal de activación.

Veamos un resumen de lo que pasa con los linfocitos T vírgenes una vez que salen del timo:

1. Los linfocitos T vírgenes recirculan continuamente entre la sangre y la linfa. Poseen la capacidad de extravasarse desde la corriente sanguínea hasta alguno de los órganos linfoides secundarios, debido a las interacciones entre sus receptores de alojamiento y las diriginas vasculares de las HEV de los ganglios y del MALT. En estos órganos establecen contactos cada día con muchas células presentadoras de antígeno. Si no la encuentra, el linfocito T sale del ganglio vía linfático eferente, pasa a circulación, puede entrar a tejidos (de nuevo escrutando APC adecuadas), y eventualmente regresa al sistema linfático. De esta manera, aumenta la probabilidad de que un linfocito T encuentre la combinación adecuada de péptido:MHC para la que están preparados sus receptores TCR.
2. Cuando una célula T virgen se encuentra en la paracorteza del ganglio con una APC que le muestra la combinación adecuada de péptido:MHC, deja de migrar, y se embarca en los pasos que le conducirán a ser activada y a producir un clon de linfocitos T "armados" efectores.
3. Los tres tipos de células presentadoras de antígeno profesionales del ganglio son el macrófago, las células dendríticas interdigitantes y las células B. Estos son los únicos tipos celulares capaces de suministrar la señal coestimulatoria. En próximos temas iremos viendo cómo cada una de estas células cumplen misiones concretas, procesando antígenos de clases diferentes de microorganismos, pero ya podemos ver en los esquemas cómo cada tipo de APC se localiza en una zona o zonas determinadas del ganglio. La producción de T efectoras tarda varios días en producirse, al cabo de los cuales dichas células "armadas" salen del órgano linfoide secundario para emigrar a los sitios de infección, donde ejercerán los efectos pertinentes.

Veamos en un poco de más detalle las interacciones celulares que conducen eventualmente a la activación del linfocito T:

	Cuando las células T emigran a la paracorteza del ganglio, se van uniendo transitoriamente con las APCs que encuentran en su camino, sobre todo con las células dendríticas. Esta unión inicial es inespecífica, y en ella participan moléculas de adhesión celular: CD2 y LFA-1 de T, que reconocen respectivamente a LFA-3 y las diversas ICAM (ICAM-1, -2 y -3) de la APC.
	Esta unión, como acabamos de decir, es transitoria, y permite que mientras tanto el linfocito T "escrute" grandes números de moléculas MHC de la APC, en busca de la combinación adecuada péptido:MHC.
	Si no encuentra esa combinación específica, la célula T se despega de la APC y sigue su camino, interaccionando con otras APCs. Al cabo de unos días, si no ha encontrado el pertinente péptido antigénico enclavado en el surco de MHC, abandona el ganglio vía linfático eferente.
	Si el linfocito T encuentra su combinación péptido:MHC, la señalización a través del complejo TCR-CD3 induce un cambio conformacional en las moléculas de LFA-1, de modo que éstas aumentan su afinidad por las ICAM de la APC. Ello permite a su vez estabilizar la unión específica entre la célula T y la APC, con lo que el contacto entre ambas se prolonga (hasta varios días), de modo que da tiempo a que el linfocito T se active y prolifere hasta diferenciarse en un clon de células T armadas efectoras.

11.5.1.2   Linfocitos T efectores

Unas 48 horas después de su activación, la célula T se convierte en un blasto (aumenta su tamaño) y comienza a proliferar en el ganglio linfático, diferenciándose al cabo de 5-7 días en una subpoblación de células efectoras especializadas y otra subpoblación de T de memoria. Las células T efectoras pueden ser de tres tipos funcionales diferentes:

	TC: son las T matadoras (citotóxicas), que suelen ser fenotípicamente CD8+.
	TH1: son las denominadas T inflamatorias, y su papel estriba en activar a macrófagos. Suelen ser fenotípicamente CD4+.
	TH2: denominadas T colaboradoras o coadyuvantes en sentido estricto, especializadas en secretar ciertas citoquinas que son esenciales en la activación de células B y T. Suelen ser CD4+.

De nuevo, hagamos un avance de los detalles que veremos en temas sucesivos, cuando hablemos en extenso de cada uno de estos tipos celulares.

	Como sabemos, las T se activan en los órganos linfoides secundarios, tras su contacto con las APCs profesionales, contacto en el que reciben las dos señales (la específica y la coestimulatoria).
	Una de las manifestaciones centrales de la activación del linfocito T es que al final de la compleja cascada de fosforilaciones y desfosforilaciones que vimos se induce la expresión de varios genes, de los cuales los más importantes son el de la IL-2 y el de su receptor (IL-2R).
	La secreción autocrina de IL-2 por parte del linfocito T suministra las señales iniciales que permiten que éste entre en el ciclo celular (sale de G0): se activa y prolifera, de modo que durante 4 o 5 días de crecimiento rápido se va produciendo un clon expandido.
	Finalmente, las células procedentes de esta activación y proliferación se diferencian a células T efectoras ("armadas").

Las T efectoras, como ya sabemos, pueden ser de tres tipos, pero aparte de que cada uno posee un arsenal específico, todas comparten una serie de importantes caracteres que las distinguen de las T vírgenes:

	Sus requerimientos de activación son diferentes a las T vírgenes: ya no necesitan la señal coestimulatoria.
	Tienen más sensibilidad a la activación, en parte debido al aumento de moléculas de adhesión CD2 y LFA-1.
	En los humanos, la mitad de las T efectoras pierden la L-selectina (el receptor de alojamiento), por lo que ya no tienden a extravasarse a los órganos linfoides secundarios.
	En cambio, expresan otra molécula, la VLA-4, que permite que el T efector se una al endotelio vascular cercano al sitio de infección. De esta manera, pueden pasar a los tejidos donde se encuentra el microorganismo invasor, donde ejercerán su papel efector.

Todas las funciones efectoras de las T armadas dependen de que interaccionen adecuadamente con una célula propia, que llamaremos célula objetivo.

	Las Tc efectoras se suelen denominan linfocitos T citolíticos (CTL), y su célula objetivo es una célula diana, es decir, una célula propia nucleada infectada intracitosólicamente.
	Las TH1 (inflamatorias) tienen como objetivo a macrófagos que ya contienen en sus vacuolas algún parásito. El efecto de la unión al macrófago será su activación, que le ayudará a eliminar al invasor.
	Las TH2 (colaboradoras "clásicas") tienen como objetivo principal a los linfocitos B, a los que suministrarán señales claves para que éstos se activen, proliferen y se diferencien hasta células plasmáticas secretoras de anticuerpos.

Los detalles de cómo es la interacción concreta de cada uno de estos tipos de células T armadas con sus células objetivo los iremos tratando en temas ulteriores, pero ahora vamos a intentar hacernos una idea general de los rasgos comunes:

1. La T armada sale del órgano linfoide secundario y emigra a los tejidos donde existe infección, guiada por cambios en la membrana del endotelio ("endotelio inflamado"), que son reconocidos por receptores como el VLA-4.
2. La primera interacción de la T con su célula objetivo es a través de moléculas de adhesión celular, carentes pues de especificidad antigénica. El hecho de que la T efectora posee niveles superiores de LFA-1 y CD2 hace que se puedan unir mejor a células no presentadoras, que tienen menores niveles de ICAMs y LFA-3 que las APC.
3. La interacción inespecífica mediante moléculas de adhesión celular es breve, a no ser que en ese pequeño lapso de tiempo, el complejo TCR-CD3-correceptor interaccione con la combinación adecuada péptido:MHC. En este caso, la unión específica provoca un cambio en LFA-1, que hace que la unión entre T y la célula objetivo dure más tiempo, tiempo durante el cual la célula T libera sus moléculas efectoras al estrecho espacio intercelular que separa a ambas células.
4. En este período de interacción estable desencadenado por la unión específica, la célula T experimenta un notable fenómeno de polarización celular:

Se produce la reorganización del citoesqueleto, de modo que tanto el aparato de Golgi como el centro organizador de los microtúbulos se colocan en la zona de citoplasma cercana a la parte de la membrana que está en contacto con la célula objetivo.

Los gránulos de la célula T se orientan hacia esa zona de membrana, con la que finalmente se fusionan, liberando su contenido por exocitosis. La consecuencia es que en el estrecho espacio intercelular se produce una gran concentración de esas moléculas efectoras, que al llegar a la célula objetivo desencadenarán una serie de respuestas (dependiendo del tipo de célula-objetivo) destinadas a eliminar el parásito.

5. Esas moléculas secretadas o de membrana producidas de modo polarizado por la célula T son las mediadoras de las funciones efectoras.
6. Los linfocitos T efectores son de vida corta: al cabo de 2 o 3 días mueren por apoptosis, una vez cumplida su misión, y ante la bajada del nivel de citoquinas activadoras como la IL-2.

11.5.1.3    Linfocitos T de memoria

	Los T de memoria surgen como subpoblaciones diferenciadas a partir de la proliferación de T vírgenes y T efectores durante una respuesta primaria.
	Permanecen en reposo (fase G0) durante mucho tiempo (hasta 30 años o más), como una subpoblación expandida, una vez que ha declinado la subpoblación "hermana" de células T efectoras.
	Están preparadas para responder de un modo más rápido e intenso cuando se vuelvan a encontrar con el antígeno (en la respuesta secundaria). Ello se debe en parte a que poseen menores requerimientos para ser activadas.
	En general poseen el mismo tipo de moléculas de membrana que los T efectores correspondientes. De hecho,los T de memoria y los T efectores son difíciles de distinguir entre sí, salvo que los primeros están en fase G0 y tardan más tiempo en en responder que los T armados.
	Al igual que los T vírgenes recirculan continuamente entre la sangre y la linfa, pero al carecer de L-selectina y presentar otras moléculas de adhesión, su patrón de recirculación es distinto: Al carecer de L-selectina, no se unen a las vénulas de endotelio alto (HEV) de los ganglios. En cambio, tienden al tejido terciario (no linfoide), incluyendo la lámina propia del intestino, superficies epiteliales de pulmones, de piel, etc. En general tienden a emigrar al tejido en el que las células T progenitoras fueron estimuladas durante la respuesta primaria. Esto es un valor adaptativo, ya que es evidente que si un patógeno entró por determinado sitio, es probable que una segunda entrada de ese agente tenga lugar en el mismo tipo de tejido.

11.5.2   Células T g d

Estos linfocitos no fueron descubiertos hasta 1986, en que se reconocieron como una pequeña población de células T periféricas que expresan CD3 pero no el "típico" receptor TCR a b .

Constituyen del 5 al 10% de los T periféricos, y del 1 al 3% de los residentes en ganglios y otros órganos linfoides. Sin embargo, son muy abundantes en la piel, y los epitelios intestinal y pulmonar.

En ratón, hasta el 1% de todas las células epidérmicas son linfocitos T g d , que se conocen con el nombre de células dendríticas epidérmicas (DEC). Dichas células expresan los marcadores Thy-1, g d , CD3, pero no CD4 ni CD8. Proceden del timo.

En el epitelio intestinal existe una población diferente de linfocitos intraepiteliales (IEL). Expresan g d , CD3 y CD8, pero carecen de Thy-1 (que como vimos, es el marcador de linaje de las células T maduradas en el timo). Es probable que no procedan del timo, sino de la médula ósea.

Estos linfocitos epiteliales no recirculan, sino que son residentes fijos en esos tejidos epiteliales. Lo curioso es que en cada tipo de epitelio la población residente de T g d muestra un repertorio muy limitado de reordenaciones de segmentos variables; además proceden de "oleadas" distintas surgidas durante la vida fetal.

Hay dos primeras oleadas de células g d , cada una de las cuales se aloja en sitios distintos del animal adulto:

	la primera oleada usa el segmento Vg 5, y termina alojándose en la epidermis como células dendríticas epidérmicas (DEC).
	La segunda oleada usa el segmento Vg 6 y va a parar al epitelio del tracto respiratorio.

Ambas oleadas usan la misma región Jg y emplean el mismo tipo de cadena d . A diferencia de lo que ocurre con las a b , no hay adición de N-nucleótidos (no hay actividad de la desoxinucleotidil-transferasa terminal).

Tras las oleadadas discretas de linfocitos epiteliales tiene lugar una gran oleada continua en la que ya se usan más tipos de segmentos Vg , y ya existe adición de N-nucleótidos. Estos son los linfocitos T g d que se localizan en tejidos periféricos, o como linfocitos intraepiteliales (IEL) del intestino. Pero aún empleando mayor diversidad de receptores, exhiben una gama limitada, preparada para detectar sólo cierto tipo de antígenos.

El papel y significación de estos enigmáticos linfocitos g d es objeto de debates actualmente:

	Puesto que estos linfocitos expresan en cada epitelio un solo tipo de receptor, y puesto que no recirculan, se ha propuesto que están especializados en reconocer alteraciones de las superficies de las células epiteliales cuando son infectadas por ciertos patógenos; es decir, más que reconocer a cada patógeno concreto, lo que harían sería detectar rasgos "generales" de células epiteliales que indicarían la presencia de infección. Se cree que estos patógenos inducen proteínas anti-estrés (por ejemplo, proteínas Hsp frente al choque por calor), y de alguna manera este tipo de cambio es lo que reconocerían los linfocitos g d .
	También parece que los linfocitos intraepiteliales tienen una actividad citotolítica constitutiva: pueden matar enterocitos infectados sobre la base de que éstos poseen una expresión aberrante de moléculas de clase IB del complejo MHC. Sin embargo, no parecen estar restringidos por el MHC clásico.
	Puede que estos linfocitos sean parte de una línea de defensa inespecífica. Se ha sugerido que pueden representar el nivel más temprano y primitivo en la evolución de la inmunidad "específica" mediada por células. Estas T se habrían especializado en reconocer y combatir patógenos que entran por piel o por intestino.