Ingeniería genética
El fago M13 es un bacteriófago filamentoso compuesto por una única molécula de ADN monocatenario circular la cual tiene aproximadamente 6407 nucleótidos de longitud; esta molécula se encuentra encapsulada en una cubierta proteica formada por aproximadamente 2700 copias de la proteína mayor de recubrimiento P8, y encapuchada en los extremos por cinco copias de dos diferentes proteínas de recubrimiento menores (P9, P6, P3). La proteína de recubrimiento menor P3 permite que el fago se una a un receptor presente en la punta de los pilli del hospedadorEscherichia coli. - ......................................:http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Especial:Libro&bookcmd=download&collection_id=4d1df9c1a7b08dd0fe2eafd30414c9696747cc0f&writer=rdf2latex&return_to=Fago+M13
Virus bacterianos. Clasificación y tipos de bacteriófagos. Generalidades. Bacteriófagos con genoma de cadena sencilla. Fagos con RNA. Fagos filamentosos con DNA monocatenario. Fagos con DNA de cadena doble. Los fagos T-pares. Ciclo lítico de infección. Etapas. Fagos atenuados. El fago lambda. Ciclo lisogénico.
- El número de virus de los mares puede llegar a ser 10 veces superiores al de bacterias.
- Estos virus podrían lisas bacterias y ayudarían a mantener el ecosistema.
- A los virus que infectan bacterias se les denominan BACTERIOFAGOS (fagos, para abreviar).
Clasificación y tipos de bacteriófagos
- Las características más importantes que se consideran para la clasificación de los fagos son la MORFOLOGIA y el ÁCIDO NUCLEICO, aunque el rango de huésped que infectan también influye.
- La mayoría de los fagos tienen DNA de doble cadena como material genético.
- Las diferentes familias de fagos se pueden agrupar en las siguientes categorías morfológicas:
Ø Fagos icosaédricos sin cola
Ø Virus con colas contráctiles (los más complejos)
Ø Virus con colas no contráctiles
Ø Fagos filamentosos
Fagos con RNA: estructura y ciclo biológico del fago MS2
- RNA que actúa como mensajero.
- Se sintetiza inmediatamente, tras la infección, la RNA replicasa.
- Se sintetiza formas intermedias +RNA (FORMA REPLICATIVA).
- De la forma –RNA se sintetiza nuevamente miles de copias +RNA.
- Unas copias +RNA actúan como mensajeros y otras vuelven al inicio del ciclo.
- Pueden infectar Enterobacterias.
- Son fagos muy sencillos con solo 3-4 genes.
- MS2 es:
Ø Icosaédrico y pequeño tamaño (sin cola).
Ø Infecta E.coli. Una proteína (MADURACIÓN) colabora en la adsorción, y otros 3 genes codifican para la RNA replicasa, proteína de la CUBIERTA y la proteína de LISIS.
Ø La proteína LISIS está codificada por un gen que solapa con el de la cubierta y el de la replicasa (procedimiento común en virus pequeños).
Ø Sólo cuando se ha sintetizado la proteína de la cubierta, el RNA se “relaja” y se hace accesible el sitio de inicio de la proteína de lisis (se evita la muerte prematura de la célula).
Fagos con DNA monocatenario. El fago M13 como herramienta en biología molecular
- Dentro de los fagos con ssDNA nos encontramos 2 familias: Inoviridae (fago filamentoso M13, que infecta Enterobacterias ) y Microviridae (Enterofago fX174).
- M13:
¨ Simetría helicoidal. Tiene 6 nm de diámetro y 860 de longitud.
¨ Infectan a través de La Pili.
¨ Poseen DNA circular (+).
¨ Se forman ciertos loops por apareamientos de bases complementarias.
¨ El ciclo replicativo es complejo: mecanismo de CIRCULO RODANTE.
¨ En algunos casos puede integrarse en el genoma bacteriano.
¨ Hay solapamiento de genes
¨ Durante la replicación, se forman FORMAS REPLICATIVAS de dsDNA. El DNA (-) producido puede utilizarse para sintetizar mRNA.
¨ Puede liberarse de la célula sin lisarla, produciendo fagos continuamente.
¨ Este fago ha sido muy utilizado en BIOLOGIA MOLECULAR. Permite la secuenciación de genes por el método de Sanger. Además, hay sitio extra en el fago para introducir DNA exógeno (se puede utilizar como vector de expresión).
- FAGO fX174:
¨ Junto con MS13, es el virus ssDNA más conocido. También infecta Enterobacterias.
¨ Simetría icosaédrica con proyecciones en algunos vértices.
¨ Tiene ssDNA (+). Fue el primer ser secuenciado totalmente por FREDERICK SANGER en 1977.
¨ También tiene genes solapantes.
¨ La replicación se realiza también mediante CIRCULO RODANTE.
¨ En el proceso de replicación del círculo rodante, la proteína A produce un nick en el extremo 3’ de la cadena (+), convirtiéndose en cebador (primer) para iniciar la síntesis de nuevas cadenas lineales de ssDNA, mediante rotación de la estructura.
¨ Al completar una vuelta, la proteína A vuelve a cortar y ligar los extremos.
Fagos con DNA de cadena doble. Ciclo lítico de infección: etapas
- Es el grupo mayoritario de los bacteriófagos por número de familias, alrededor de 10 entre fagos que infectan Bacterias y Arqueobacterias (cada virus suele ser específico de géneros concretos).
- Vamos a centrarnos en el orden Caudovirales, con 3 familias de virus con “cola”: la familia Myoviridae (fagos T-pares y Mu, entre otros. Cola larga y contráctil), Siphoviridae (fago l, como más destacado. Cola larga y NO-contráctil), y Podoviridae (T7, f29, el fago que hizo famoso al CBM. Cola CORTA NO-contráctil).
- El 96 % de todos los bacteriófagos descritos están dentro de este grupo, con más de 4500 miembros en la actualidad.
- Características generales:
Ø Virión sin envuelta.
Ø Cápsida icosaédrica (CABEZA) proteica que contiene una molécula de dsDNA.
Ø Un tubo helicoidal para la adsorción e inyección del DNA dentro de la célula huesped (COLA).
Ø Un CONECTOR que une ambos elementos.
Ø Las infecciones pueden ser VIRULENTAS (lisis celular) o ATEMPERADAS (no hay lisis y el virus puede integrarse en el genoma celular o coexistir como elemento extracromosómico).
- Con virus de este tipo se averiguó que el DNA era el material genético (S. Luria y D. Hershey, premio Nobel); la recombinación en virus; las enzimas de restricción; funciones tempranas y tardías víricas,etc…
- Los primeros virus estudiados dsDNA empezaron a numerarse desde T1-T7.
ENTEROBACTERIOFAGO T4:
§ Cabeza de gran tamaño y una cola larga.
§ Collar proteico y plataforma basal con fibras largas.
§ El genoma grande (unos 170 kpb).
§ Otra curiosidad es que el virus puede sintetizar para algunos tRNA propios.
§ El DNA tiene REPETICIONES TERMINALES DIRECTAS (entre 3000 y 6000 bp).
§ El DNA es 650 veces más largo que la cabeza, por lo que el empaquetamiento se realiza concienzudamente.
§ El DNA de T4 es químicamente distinto del DNA celular, teniendo, en lugar de citosina, la base 5-HYDROXYMETILCITOSINA, haciendo prácticamente resistente a cualquier enzima de restricción bacteriano.
§ Genéticamente, el DNA de T4 se representa como un círculo, aún cuando el genoma es en sí lineal, debido al fenómeno denominado PERMUTACION CIRCULAR.
§ Esto se debe a que para cada virus, la secuencia terminal del DNA puede variar, aunque las repeticiones del principio y final del genoma están presentes para cada virión. Explicación: Mecanismo de replicación:
Ø Desde un origen de replicación único, se forma un OJO de replicación, que acabará formando la horquilla típica de replicación bidireccional.
Ø Hay un extremo que queda temporalmente libre (en la forma Y) donde está la secuencia repetida. Esta secuencia puede asociarse con la cadena complementaria del extremo opuesto, formándose un CONCATEMERO, tras rellenarse los huecos con DNApol y DNA ligasa.
Ø El problema de T4, que no tienen otros virus T impares (T7, por ejemplo) es que estos concatémeros serán cortados por una enzima que no corta sitios específicos, sino que lo hace cuando la cabeza del virión está llena.
Ø Esto ocurre con algo más de un genoma, por lo que se originarán virus con extremos repetidos.
Abcd.............AbcdAbcd..............AbcdAbcd................AbcdAbcd...........Abcd
Al cortarse el genoma (Abcd..........Abcd) por una enzima que no es específica de nucleótido, se desplaza la secuencia, dando la sensación de una estructura genéticamente circular:
Abcd............AbcdA Bcde.....................AbcdAb Cdef.................AbcdAbc etc.
§ La síntesis proteica se agrupa en 3 categorías: proteínas TEMPRANAS, MEDIAS y TARDIAS.
Ø Las dos primeras están involucradas en la síntesis y replicación del DNA, mientras que las tardías forman la cabeza y la cola, así como enzimas involucradas en la liberación del virión.
ENTEROBACTERIOFAGO: Mu:
- Pertenece a la misma familia que T4, pero con peculiaridades importantes.
- El genoma contiene secuencias terminales del hospedador, debido a que puede integrarse en cualquier sitio del cromosoma bacteriano.
- Tienen alrededor de 37 kb de secuencia específica del fago, flanqueado por 0.5-3 kb de segmento covalentemente unido del huesped (50-150 bases a la izquierda y entre 1-2 kbp a la derecha (de donde estuvo integrado…).
- Tras la infección de la enterobacteria el DNA circulariza y se puede producir ciclo lítico ó lisogénico (ambos requieren integración del genoma).
- Para la integración se corta de forma “cohesiva” el DNA celular, con 5 bases desplazadas, que, al integrarse el fago, se rellenarán, duplicándose en 5 bases el DNA celular.
- El nombre de Mu se debe a que es un fago MUTADOR.
- Actúa como un elemento TRANSPOSÓNICO.
- El DNA viral integrado, se corta unas pocas bases a la derecha del genoma, que empieza a llenar la cápsida, con material celular extra.
- La transcripción corre a cuenta de la RNApol celular y se separa en tránscritos tempranos y tardíos. Tras el ensamblaje, se produce la lisis celular.
FAGO P1:
- También pertenece a la familia Myoviridae. Se parece morfológicamente a Mu, pero más grande y con variantes de distintos tamaños de la cabeza.
- También sufre, como T4, permutación circular...
- Sin embargo, comparte características similares al fago l, en que puede entrar en lisogenia tras circularizarse, pero NO SE INTEGRA en el genoma bacteriano (suele ser E.coli). Se replica junto a la bacteria y también codifica para un represor.
- Está implicado en transducción: Puede encapsidar hasta un 2-2,5% del genoma de la bacteria. Se emplea para clonar y expresar grandes cantidades de ADN (hasta 80-90 Kb), formando los llamadosPACs (P1 artificial chromosomes).
ENTEROFAGO l:
- Es el virus ATENUADO más conocido.
- El virus puede entrar en ciclo lítico o lisogénico.
- Durante la lisogenia, el DNA viral se replica con el celular. Aquí, el fago se denomina PROFAGO.
- En función de unos represores, el virus se puede mantener en lisogenia. En este caso, la célula se hace INMUNE contra otra infección por el mismo tipo de fago.
- Mientras dura la lisogenia, procedimientos que dañen el DNA, como la luz UV, pueden inactivar el profago y la célula será CURADA completamente.
- Es un virus icosaédrico con una cabeza de unos 64 nm de diámetro y una cola de 150 nm de longitud con simetría helicoidal.
- Dispone de una única fibra unida a la cola con 23 nm de longitud, terminal, y varias fibras subterminales.
- El genoma es una molécula de dsDNA lineal, pero tiene extremos cohesivos, es decir, en posición 5’ de cada extremo tiene unos 12 nucleótidos sin aparear.
- Al infectarse una bacteria, el DNA del fago se circulariza y empieza la expresión del genoma.
- A ambos lados de la región reguladora con cI (proteína represora) se encuentran los promotores PL y PR . PR puede codificar para la proteína que hace activarse el ciclo lítico, Cro.
- El producto de cI (REPRESOR LAMBDA) inhibe la transcripción del resto de las proteínas virales.
- Aunque está entre los promotores PL y PR, ninguno de estos transcriben cI, por estar orientados de espaldas a él.
- El promotor que produce mRNA de cI se llama PE y está a la derecha de cro, y en dirección opuesta a PR.
- Si se transcriben los genes O y P, implicados en la iniciación de replicación del DNA, se encauza el ciclo lítico...
- OR tiene 3 sitios (análogamente ocurre con OL) donde Cro puede unirse: primero se une al sitio 3, luego, cuando está lleno, al sitio 2 y, finalmente, al sitio 1, bloqueando, solo entonces, al promotor PR. De forma completamente inversa se une cI a esos promotores.
- Cuando PL y PR están bloqueados, no se sintetiza ni cII ni cIII, necesarias para entrar en lisogenia, por lo que el fago entra en ciclo lítico.
- El producto de cII activa PE, así como los genes implicados en integración (integrasas).
- CII se degrada fácilmente, y necesita al producto de cIII para estabilizarse.
- Para mantener la lisogenia, existe un promotor denominado PM (mantenimiento), que está de cara a cI y en la misma dirección que PE.
- La replicación del DNA del fago se realiza por el método círculo rodante.
- La integración del fago (sitio att) ocurre en un sitio único del cromosoma bacteriano (cerca del operón gal).
- La inducción del ciclo lítico se realiza mediante agentes que dañen el DNA bacteriano, como la luz UV. Se activa el mecanismo de reparación de la bacteria denominado SOS.
- Una de las proteínas implicadas, la RecA actúa como proteasa degradando al represor del fago, permitiendo la expresión de los genes del ciclo lítico.
Resumen del ciclo lisogénico: Después de la circularización del DNA del fago, se sintetiza cII y cIII, que se acumulan rápidamente. cII activa PE (repressor establishment) y estimula la expresión de cI (represor lambda). Este se une a OL y OR, inhibiendo la síntesis proteica. cI puede seguir sintetizándose por la actividad de PM (repressor maintenance), que es activado por el propio represor. Por otra parte, al mismo tiempo que se acumula cI, también lo puede hacer cro, que también se une a OL y a OR, cancelando la transcripción del represor y de PM. Hay una competencia entre ambos procesos.
ENTEROBACTERIOFAGO T7:
- Bastantes analogías en cuanto a replicación y regulación con T4, pero bastante más pequeño y simple.
- Como peculiaridad cabe destacar que codifican para sus propias DNA y RNA polimerasas.
- El mapa genético es lineal y con redundancias (repeticiones) terminales.
- Existen solapamientos genéticos y otras estrategias para aumentar la capacidad codificante.
- Mediante repeticiones terminales se acaban formando concatémeros similares a los de T4, pero en el caso de T7 el corte posterior de los concatémeros es específico.
- Estos fagos no entran en lisogenia, son muy virulentos y pueden infectar bacterias gram-negativas entéricas o relacionadas.
v Dentro de la familia Podoviridae también se encuentra el fago f29, parecido a T7.
v Cabeza alargada, cola y un curioso collar doble con apéndices.
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