El cultivo celular es el proceso mediante el cual las células se cultivan en condiciones controladas, generalmente fuera de su entorno natural. Una vez que las células de interés se han aislado del tejido vivo , pueden mantenerse posteriormente en condiciones cuidadosamente controladas. Estas condiciones varían para cada tipo de célula, pero generalmente consisten en un recipiente adecuado con un sustrato o medio que suministra los nutrientes esenciales ( aminoácidos , carbohidratos , vitaminas , minerales ), factores de crecimiento , hormonas y gases ( CO 2 , O 2).), y regula el entorno físico-químico ( pH buffer, presión osmótica , temperatura ). La mayoría de las células requieren una superficie o un sustrato artificial (cultivo adherente o monocapa), mientras que otras pueden crecer libres flotando en el medio de cultivo ( cultivo en suspensión). La vida útil de la mayoría de las células está determinada genéticamente, pero algunas células de cultivo celular se han "transformado" en células inmortales que se reproducirán indefinidamente si se proporcionan las condiciones óptimas.
En la práctica, el término "cultivo celular" se refiere ahora a la de cultivo de células derivadas de multicelulares eucariotas , especialmente animalescélulas, en contraste con otros tipos de cultura que también crecen las células, tales como cultivo de tejidos vegetales , hongos cultura, y cultivo microbiológico ( de microbios ). El desarrollo histórico y los métodos del cultivo celular están estrechamente relacionados con los del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos . El cultivo viral también está relacionado, con las células como hospedadores de los virus.
La técnica de laboratorio de mantener líneas celulares vivas (una población de células descendientes de una sola célula y que contiene la misma composición genética) separadas de su fuente de tejido original se volvió más robusta a mediados del siglo XX.
Historia [ editar ]
El fisiólogo inglés Sydney Ringer del siglo XIX desarrolló soluciones de sal que contenían cloruros de sodio, potasio, calcio y magnesio, adecuados para mantener el latido de un corazón de animal aislado fuera del cuerpo. [3] En 1885, Wilhelm Roux extrajo una porción de la placa medular de un pollo embrionario y la mantuvo en una solución salina caliente durante varios días, estableciendo el principio del cultivo de tejidos. [4] Ross Granville Harrison , que trabaja en la Escuela de Medicina Johns Hopkins y luego en la Universidad de Yale., publicó los resultados de sus experimentos desde 1907 hasta 1910, estableciendo la metodología del cultivo de tejidos . [5]
Las técnicas de cultivo celular avanzaron significativamente en los años 1940 y 1950 para apoyar la investigación en virología . El crecimiento de virus en cultivos celulares permitió la preparación de virus purificados para la fabricación de vacunas . La vacuna inyectable contra la poliomielitis desarrollada por Jonas Salk fue uno de los primeros productos producidos en masa utilizando técnicas de cultivo celular. Esta vacuna fue posible gracias a la investigación sobre cultivos celulares de John Franklin Enders , Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman Robbins , quienes recibieron un Premio Nobel por su descubrimiento de un método para cultivar el virus en cultivos de células de riñón de mono .
Conceptos en cultivo de células de mamífero [ editar ]
Aislamiento de células [ editar ]
Las células se pueden aislar de los tejidos para el cultivo ex vivo de varias maneras. Las células se pueden purificar fácilmente de la sangre; sin embargo, solo las células blancas son capaces de crecer en cultivo. Las células se pueden aislar de tejidos sólidos mediante la digestión de la matriz extracelular utilizando enzimascomo la colagenasa , tripsina o pronasa , antes de agitar el tejido para liberar las células en suspensión. [6] [7]Alternativamente, se pueden colocar pedazos de tejido en medios de crecimiento , y las células que crecen están disponibles para el cultivo. Este método se conoce como cultivo de explantes .
Las células que se cultivan directamente de un sujeto se conocen como células primarias. Con la excepción de algunos derivados de tumores, la mayoría de los cultivos celulares primarios tienen una vida útil limitada.
Una línea celular establecida o inmortalizada ha adquirido la capacidad de proliferar indefinidamente a través de una mutación aleatoria o una modificación deliberada, como la expresión artificial del gen de la telomerasa . Numerosas líneas celulares están bien establecidas como representativas de tipos celulares particulares .
El mantenimiento de células en cultivo [ editar ]
Para la mayoría de las células primarias aisladas, se someten al proceso de senescencia y dejan de dividirse después de un cierto número de duplicaciones de población, mientras que en general conservan su viabilidad (descrito como el límite de Hayflick ).
Las células se cultivan y se mantienen a una apropiada temperatura de la mezcla y gas (típicamente, 37 ° C, 5% de CO 2 para células de mamífero) en un incubador de células . Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo de célula, y la variación de las condiciones para un tipo de célula particular puede resultar en diferentes fenotipos .
Aparte de la temperatura y la mezcla de gases, el factor más comúnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento celular . Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH , concentración de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros nutrientes. Los factores de crecimiento utilizados para complementar los medios a menudo se derivan del suero de sangre animal, como el suero bovino fetal (FBS), suero de ternera bovina, suero equino y suero porcino. Una complicación de estos ingredientes derivados de la sangre es el potencial de contaminación del cultivo con virus o priones , particularmente en biotecnología médica.aplicaciones La práctica actual es minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes siempre que sea posible y utilizar lisado de plaquetas humanas (hPL). [8]Esto elimina la preocupación de la contaminación de especies cruzadas cuando se usa FBS con células humanas. hPL se ha convertido en una alternativa segura y confiable como reemplazo directo de FBS u otro suero animal. Además, los medios químicamente definidos pueden usarse para eliminar cualquier rastro de suero (humano o animal), pero esto no siempre se puede lograr con diferentes tipos de células. Las estrategias alternativas incluyen la obtención de sangre animal de países con un riesgo mínimo de EEB / EET , como los Estados Unidos, Australia y Nueva Zelanda, [9]y el uso de concentrados de nutrientes purificados derivados de suero en lugar de suero animal completo para cultivo celular. [10]
La densidad de placas (número de células por volumen de medio de cultivo) desempeña un papel crítico para algunos tipos de células. Por ejemplo, una menor densidad de placas hace que las células de la granulosamuestren producción de estrógeno, mientras que una mayor densidad de placas hace que aparezcan como células de luteína de teca que producen progesterona . [11]
Las células se pueden cultivar en suspensión o en cultivos adherentes. Algunas células viven naturalmente en suspensión, sin estar unidas a una superficie, como las células que existen en el torrente sanguíneo. También hay líneas celulares que se han modificado para poder sobrevivir en cultivos en suspensión para que puedan crecer a una densidad más alta de lo que permitirían las condiciones adherentes. Las células adherentes requieren una superficie, como plástico de cultivo de tejidos o microportador, que puede recubrirse con componentes de matriz extracelular (como colágeno y laminina) para aumentar las propiedades de adhesión y proporcionar otras señales necesarias para el crecimiento y la diferenciación. La mayoría de las células derivadas de tejidos sólidos son adherentes. Otro tipo de cultivo adherente es el cultivo organotípico, que implica el crecimiento de células en un entorno tridimensional (3-D) en oposición a los platos de cultivo bidimensional. Este sistema de cultivo 3D es bioquímicamente y fisiológicamente más similar al tejido in vivo , pero es técnicamente difícil de mantener debido a muchos factores (por ejemplo, la difusión).
Componentes de los medios de cultivo celular [ editar ]
| Componente | Función |
|---|---|
| Fuente de carbono (glucosa /glutamina ) | Fuente de energía |
| Aminoácidos | Bloques de construcción de proteínas |
| Vitaminas | Promover la supervivencia y el crecimiento celular. |
| Solución salina equilibrada | Una mezcla isotónica de iones para mantener la presión osmótica óptima dentro de las células y proporcionar iones metálicos esenciales para actuar como cofactores para reacciones enzimáticas, adhesión celular, etc. |
| Colorante rojo fenol | indicador de pH . El color del rojo fenol cambia de naranja / rojo a pH 7-7.4 a amarillo a pH ácido (más bajo) y púrpura a pH básico (más alto). |
| Bicarbonato / HEPES tampón | Se utiliza para mantener un pH equilibrado en el medio. |
Condiciones típicas de crecimiento [ editar ]
| Parámetro | |
|---|---|
| Temperatura | 37 ° C |
| CO2 | 5% |
| Humedad relativa | 95% |
La línea celular contaminación cruzada [ editar ]
La contaminación cruzada de líneas celulares puede ser un problema para los científicos que trabajan con células cultivadas. [12] Los estudios sugieren que entre el 15 y el 20% de las veces, las células utilizadas en experimentos se identificaron erróneamente o se contaminaron con otra línea celular. [13] [14] [15] Incluso se han detectado problemas con la contaminación cruzada de líneas celulares en las líneas del panel NCI-60 , que se usan de manera rutinaria para los estudios de detección de drogas. [16] [17] Repositorios de líneas celulares principales, incluida la American Type Culture Collection(ATCC), la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ), han recibido presentaciones de líneas celulares de investigadores que fueron identificados erróneamente por ellos. [16] [18] Dicha contaminación plantea un problema para la calidad de la investigación producida utilizando líneas de cultivo celular, y los repositorios principales ahora están autentificando todos los envíos de líneas celulares. [19] ATCC utiliza las huellas dactilares de ADN de repetición en tándem corta (STR) para autenticar sus líneas celulares. [20]
Para abordar este problema de la contaminación cruzada de líneas celulares, se recomienda a los investigadores que autentiquen sus líneas celulares en un paso temprano para establecer la identidad de la línea celular. La autenticación debe repetirse antes de congelar las existencias de líneas celulares, cada dos meses durante el cultivo activo y antes de cualquier publicación de datos de investigación generados utilizando las líneas celulares. Se utilizan muchos métodos para identificar líneas celulares, como el análisis de isoenzimas , la tipificación del antígeno linfocítico humano (HLA), el análisis cromosómico, el cariotipo, la morfología y el análisis STR . [20]
Otras cuestiones técnicas [ editar ]
Como las células generalmente continúan dividiéndose en el cultivo, generalmente crecen para llenar el área o volumen disponible. Esto puede generar varios problemas:
- Agotamiento de nutrientes en los medios de crecimiento.
- Cambios en el pH de los medios de crecimiento.
- Acumulación de células apoptóticas / necróticas (muertas)
- El contacto célula a célula puede estimular la detención del ciclo celular, haciendo que las células dejen de dividirse, lo que se conoce como inhibición de contacto .
- El contacto célula a célula puede estimular la diferenciación celular .
- Las alteraciones genéticas y epigenéticas , con una selección natural de las células alteradas, potencialmente conducen a un crecimiento excesivo de células anormales, adaptadas al cultivo, con menor diferenciación y mayor capacidad proliferativa. [21]
La manipulación de células cultivadas [ editar ]
Entre las manipulaciones comunes que se llevan a cabo en las células de cultivo se encuentran los cambios en los medios, las células de pases y las células transfectantes. Estos se realizan generalmente utilizando métodos de cultivo de tejidos que se basan en una técnica aséptica . La técnica aséptica tiene como objetivo evitar la contaminación con bacterias, levaduras u otras líneas celulares. Las manipulaciones se realizan normalmente en un gabinete de bioseguridad o en un gabinete de flujo laminar para excluir los microorganismos contaminantes. También se pueden agregar antibióticos (por ejemplo, penicilina y estreptomicina ) y antifúngicos (por ejemplo, anfotericina B ) a los medios de crecimiento.
A medida que las células experimentan procesos metabólicos, se produce ácido y el pH disminuye. A menudo, se agrega un indicador de pH al medio para medir el agotamiento de nutrientes.
Cambios en los medios [ editar ]
En el caso de los cultivos adherentes, los medios se pueden eliminar directamente por aspiración y luego se reemplazan. Los cambios en los medios en cultivos no adherentes implican centrifugar el cultivo y resuspender las células en medios frescos.
Células pases [ editar ]
El pasaje (también conocido como subcultivo o división de células) implica transferir una pequeña cantidad de células a un nuevo recipiente. Las células pueden cultivarse durante más tiempo si se dividen regularmente, ya que evita la senescencia asociada con la alta densidad celular prolongada. Los cultivos en suspensión se pasan fácilmente con una pequeña cantidad de cultivo que contiene unas pocas células diluidas en un mayor volumen de medio fresco. Para los cultivos adherentes, las células primero deben separarse; esto se hace comúnmente con una mezcla de tripsina - EDTA ; sin embargo, otras mezclas de enzimas ahora están disponibles para este propósito. Una pequeña cantidad de células desprendidas se puede usar para sembrar un nuevo cultivo. Algunos cultivos celulares, como las células RAW, se raspan mecánicamente de la superficie de su recipiente con raspadores de goma.
La transfección y transducción [ editar ]
Otro método común para manipular células consiste en la introducción de ADN extraño por transfección . Esto se realiza a menudo para hacer que las células expresen un gen de interés. Más recientemente, la transfección de construcciones de ARNi se ha realizado como un mecanismo conveniente para suprimir la expresión de un gen / proteína particular. El ADN también se puede insertar en las células utilizando virus, en métodos denominados transducción , infección o transformación . Los virus, como agentes parasitarios, son muy adecuados para introducir ADN en las células, ya que esto es parte de su curso normal de reproducción.
No hay comentarios:
Publicar un comentario