Biotecnología

Los cósmidos son vectores de clonación, que han sido ampliamente usados en la elaboración de genotecas de DNA genómicos de gran tamaño, ya que permiten la introducción de insertos de DNA de hasta 45 kb, el doble que los vectores derivados de la eliminación de parte del genoma del fago λ, los fagémidos.

Realmente un cósmido consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacteriófago, el fago λ.

Un cósmido contiene:

• Del plásmido, el ori C y un gen de resistencia a un antibiótico, esto depende del tipo de plásmido del cual derive y, por tanto puede contener más segmentos como por ejemplo el gen LacZ, que permite la selección blanco/azul de las colonias.
• Del fago λ, los extremos COS, extremos complementarios del genoma del fago y que se emplean para la recircularización del mismo.

Estos vectores facilitan el trabajo porque permiten el empaquetamiento in vitro de las secuencias entre dos extremos COS y usar los fagos empaquetados para transfectarcepas de E. coli, consiguiendo un plásmido en la bacteria, ya que el cósmido se recirculariza al entrar gracias a los extremos COS.

También tiene genes de resistencia a antibióticos de origen plasmídico, que ayudan en la identificación de células huéspedes que contienen los cósmicos recombinantes. Después de insertar fragmentos de DNA, los cósmidos recombinantes se empaquetan en la cápside proteica de λ para formar partículas fágicas infectivas. Una vez que en la célula huésped, el cósmido se replica como plásmido.

biologia molecular10. cosmidoJean-Pierre HERVEG y Maritza BARCIA-MACAYCochabamba, Bolivia, 2004

plan

A. Introducción 1. tamaño ó talla de los insertos. 2. Las secuencias cos 3. un plásmido con secuencias cos B. Etapas de clonaje C. fragmentación de ADN génomico

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A. Introducción 1. tamaño de los insertos En el fago lambda, se puede introducir un fragmento de ADN eucariótico de 15 a 20 kb. Sinembargo hay gens con tallas superiores a 20 kb. La familia des gens de globina están alrededor de 70 kb y otras familias más grADNes pueden ocupar cientos de kb. Es para eso que se utilizan los cósmidos. 2. secuencias cos Como lo hemos visto, el ADN del fago lambda posee extremos cos. Durante el ciclo lítico, cientos de copias de ADN del fago lambda forman un concatémero, cada genoma de fago enlacado al siguiente mediante secuencias cos.

Las enzimas de encapsulación separan ése concatémero en fragmentos de la talla de un genoma lambda reconociendo dos secuencias cos distantes de 38 a 51 kb é introduciendo cada unidad de fago lambda en una cabeza de fago. Las secuencias cos son las únicas señales necesarias para la encapsulación de ADN en la cabeza de los fagos. 3. un plásmido con secuencias cos Un cósmido es un plásmido en el cual se han clonado las secuencias cos necesarias para la encapsulación de partículas de fago lambda. Un cósmido presenta las 5 características siguientes: 1. un gen de resistencia a uno ó más antibióticos 2. un orígen de replicación de plásmido 3. una horquilla de replicación (polilinker) 4. una ó dos secuencias cos 5. una talla pequeña : alrededor de 5 kb

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B. Etapas de clonaje El cósmido es introducido en la E. coli donde será multiplicado. Es enseguida purificado como un plásmido. El cósmido es hidrolisado por Sma I. El cósmido linearizado es tratado con fosfatasa alcalina y enseguida hidrolizado con Bam HI.
El inserto es preparado y ligado entre los brazos. El inserto se replica como un plásmido. Las partículas de fago recombinante se meten en presencia de bacterias E. coli. El ADN recombinante es injectado en la célula donde el se enrolla en circúlo utilizADNo los extremos cos. El gen de resistencia a la kanamycina se pierde! El ADN no se comporta más como ADN de fago, puesto que el se replica como un gran plásmido y exprime ésta vez la resistencia a la ampicilina. De manera de evitar una recombinación entre las secuencias repetidas de los fragmentos de ADN eucarióticos clonados, se infecta genralmente bacterias recA-. El producto del gen recA es un producto bacteriano mayor que provoca una recombinación que favorece la transferencia de hebras entre moléculas de ADN. A pesar de ésta precaución, del 1 al 2 % de cósmidos recombinandos son bien inestables y sufren mal asemblajes ó borrados luego de haber sido inyectados en las bacterias. Los bancos de cósmidos pueden conservarse en forma de suspensión de partículas de fago, ó como más a menudo pasa, en forma de una población amplificada de bacterias infectadas.

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C. fragmentación del ADN genómico El ADN genómico es parcialmente hidrolizado por Sau3AI ó Mbo I de acuerdo a un método stADNart para la obtención de fragmentos de 35 a 45 kb. Esos fragmentos se purifican en un gradiente de NaCl. Para evitar que un mínimo de fragmentos à insertar no posean que solo un extremo adhesivo en lugar de dos, es necesario que la talla del ADN al comenzar sea varias veces superior a aquella de los fragmentos que pudieran obtenerse después de la digestión parcial. La figura aquí muestra que cinco Mbo I sucesivos en una secuencia de 200 kb producen 4 fragmentos insertables (vedes) y 2 fragmentos no-insertables (rojo).