Métodos en desarrollo [ editar ]
Los métodos de secuenciación de ADN actualmente en desarrollo incluyen la lectura de la secuencia como una cadena de ADN que transita a través de nanoporos (un método que ahora es comercial, pero las generaciones posteriores, como los nanoporos de estado sólido, aún están en desarrollo), [104] [105] y técnicas basadas en microscopía , como la microscopía de fuerza atómica o la microscopía electrónica de transmisión que se utilizan para identificar las posiciones de nucleótidos individuales dentro de fragmentos de ADN largos (> 5,000 pb) mediante el etiquetado de nucleótidos con elementos más pesados (por ejemplo, halógenos) para la detección y el registro visual. [106] [107] Tecnologías de tercera generaciónEl objetivo es aumentar el rendimiento y disminuir el tiempo de resultado y costo al eliminar la necesidad de reactivos excesivos y aprovechar la procesividad de la ADN polimerasa. [108]
Corrientes túnel secuenciación de ADN [ editar ]
Otro enfoque utiliza mediciones de las corrientes de tunelización eléctrica a través del ADN de una sola hebra a medida que se mueve a través de un canal. Dependiendo de su estructura electrónica, cada base afecta la corriente de tunelización de manera diferente, [109] permitiendo la diferenciación entre diferentes bases. [110]
El uso de corrientes de tunelización tiene el potencial de secuenciar órdenes de magnitud más rápido que los métodos de corriente iónica y ya se ha logrado la secuenciación de varios oligómeros de ADN y micro-ARN. [111]
Secuenciación por hibridación [ editar ]
La secuenciación por hibridación es un método no enzimático que utiliza una micromatriz de ADN . Un único grupo de ADN cuya secuencia se va a determinar se marca de forma fluorescente y se hibrida con una matriz que contiene secuencias conocidas. Las fuertes señales de hibridación de un punto dado en la matriz identifican su secuencia en el ADN que se está secuenciando. [112]
Este método de secuenciación utiliza características de unión de una biblioteca de moléculas de ADN de cadena simple corta (oligonucleótidos), también llamadas sondas de ADN, para reconstruir una secuencia de ADN objetivo. Los híbridos no específicos se eliminan mediante lavado y el ADN diana se eluye. [113] Los híbridos se reorganizan de tal manera que la secuencia de ADN se puede reconstruir. El beneficio de este tipo de secuenciación es su capacidad para capturar una gran cantidad de objetivos con una cobertura homogénea. [114]Generalmente se requiere una gran cantidad de químicos y ADN de partida. Sin embargo, con la llegada de la hibridación basada en soluciones, se necesitan mucho menos equipos y productos químicos. [113]
Secuenciación con espectrometría de masas [ editar ]
La espectrometría de masas se puede utilizar para determinar las secuencias de ADN. La espectrometría de masas con tiempo de vuelo de ionización por desorción asistida por matriz, o MALDI-TOF MS , se ha investigado específicamente como un método alternativo a la electroforesis en gel para visualizar fragmentos de ADN. Con este método, los fragmentos de ADN generados por las reacciones de secuenciación de terminación de cadena se comparan por masa en lugar de por tamaño. La masa de cada nucleótido es diferente de las otras y esta diferencia es detectable por espectrometría de masas. Las mutaciones de un solo nucleótido en un fragmento pueden detectarse más fácilmente con MS que mediante electroforesis en gel sola. MALDI-TOF MS puede detectar más fácilmente las diferencias entre los fragmentos de ARN, por lo que los investigadores pueden secuenciar indirectamente el ADN con métodos basados en la EM convirtiéndolo en ARN primero. [115]
La resolución más alta de los fragmentos de ADN permitidos por los métodos basados en la EM es de especial interés para los investigadores en ciencia forense, ya que pueden desear encontrar polimorfismos de un solo nucleótido en muestras de ADN humano para identificar individuos. Estas muestras pueden estar altamente degradadas, por lo que los investigadores forenses a menudo prefieren el ADN mitocondrial por su mayor estabilidad y aplicaciones para estudios de linaje. Los métodos de secuenciación basados en MS se han utilizado para comparar las secuencias de ADN mitocondrial humano de muestras en una base de datos de la Oficina Federal de Investigaciones [116] y de huesos encontrados en fosas comunes de soldados de la Primera Guerra Mundial. [117]
Los primeros métodos de terminación de cadena y TOF MS demostraron longitudes de lectura de hasta 100 pares de bases. [118] Los investigadores no han podido superar este tamaño promedio de lectura; como la secuenciación de terminación de cadena sola, la secuenciación de ADN basada en MS puede no ser adecuada para grandes proyectos de secuenciación de novo . Aun así, un estudio reciente usó las lecturas de secuencia corta y la espectroscopia de masas para comparar polimorfismos de un solo nucleótido en cepas patógenas de Streptococcus . [119]
Microfluidos Sanger secuenciación [ editar ]
En la secuenciación de Sanger microfluídica, la amplificación completa del termociclado de los fragmentos de ADN, así como su separación por electroforesis, se realiza en una sola oblea de vidrio (aproximadamente 10 cm de diámetro), lo que reduce el uso de reactivos y el costo. [120] En algunos casos, los investigadores han demostrado que pueden aumentar el rendimiento de la secuenciación convencional mediante el uso de microchips. [121] Será necesario realizar investigaciones para que este uso de la tecnología sea efectivo.
Las técnicas basadas en Microscopía [ editar ]
Este enfoque visualiza directamente la secuencia de las moléculas de ADN mediante microscopía electrónica. La primera identificación de pares de bases de ADN dentro de moléculas de ADN intactas incorporando enzimáticamente bases modificadas, que contienen átomos de número atómico aumentado, visualización directa e identificación de bases marcadas individualmente dentro de una molécula de ADN sintética de 3.272 pares de bases y un genoma viral de 7.249 pares de bases. ha sido demostrado. [122]
Secuenciación RNAP [ editar ]
Este método se basa en el uso de la ARN polimerasa (RNAP), que se une a una perla de poliestireno . Un extremo del ADN que debe secuenciarse está unido a otra cuenta, con ambas cuentas colocadas en trampas ópticas. El movimiento RNAP durante la transcripción acerca las cuentas y sus cambios de distancia relativa, que luego se pueden registrar con una resolución de un solo nucleótido. La secuencia se deduce en base a las cuatro lecturas con concentraciones reducidas de cada uno de los cuatro tipos de nucleótidos, de manera similar al método de Sanger. [123] Se realiza una comparación entre regiones y la información de secuencia se deduce comparando las regiones de secuencia conocidas con las regiones de secuencia desconocidas. [124]
In vitro virus de alto rendimiento de secuenciación [ editar ]
Se ha desarrollado un método para analizar conjuntos completos de interacciones de proteínas utilizando una combinación de 454 pirosecuenciaciones y un método de visualización de ARNm de virus in vitro . Específicamente, este método une de manera covalente las proteínas de interés a los ARNm que los codifican, y luego detecta las piezas de ARNm utilizando PCR de transcripción inversa . El ARNm puede entonces amplificarse y secuenciarse. El método combinado se tituló IVV-HiTSeq y se puede realizar en condiciones sin células, aunque sus resultados pueden no ser representativos de las condiciones in vivo . [125]
Preparación de la muestra [ editar ]
El éxito de cualquier protocolo de secuenciación de ADN se basa en la extracción y preparación de muestras de ADN o ARN a partir del material biológico de interés.
- Una extracción de ADN exitosa producirá una muestra de ADN con hebras largas y no degradadas.
- Una extracción de ARN exitosa producirá una muestra de ARN que debe convertirse en ADN complementario (ADNc) utilizando la transcriptasa inversa, una polimerasa de ADN que sintetiza un ADN complementario basado en cadenas de ARN existentes de manera similar a una PCR. [126] El ADN complementario puede procesarse de la misma manera que el ADN genómico.
De acuerdo con la tecnología de secuenciación que se utilizará, las muestras resultantes de la extracción de ADN o de ARN requieren una preparación adicional. Para la secuenciación de Sanger, se requieren procedimientos de clonación o PCR antes de la secuenciación. En el caso de los métodos de secuenciación de próxima generación, se requiere la preparación de la biblioteca antes del procesamiento. [127] La evaluación de la calidad y la cantidad de ácidos nucleicos después de la extracción y después de la preparación de la biblioteca identifica muestras degradadas, fragmentadas y de baja pureza y proporciona datos de secuenciación de alta calidad. [128]
Iniciativas de desarrollo [ editar ]
En octubre de 2006, la X Prize Foundation estableció una iniciativa para promover el desarrollo de tecnologías de secuenciación del genoma completo , llamada Archon X Prize , con la intención de otorgar $ 10 millones al "primer equipo que puede construir un dispositivo y usarlo para secuenciar 100 genomas humanos". "dentro de 10 días o menos, con una precisión de no más de un error en cada 100,000 bases secuenciadas, con secuencias que cubren con precisión al menos el 98% del genoma, y con un costo recurrente de no más de $ 10,000 (US) por genoma". [129]
Cada año, el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano , o NHGRI, promueve subvenciones para nuevas investigaciones y desarrollos en genómica . Las subvenciones de 2010 y los candidatos de 2011 incluyen trabajo continuo en metodologías de secuenciación de base microfluídica, polonia y base. [130]
Desafíos computacionales [ editar ]
Las tecnologías de secuenciación que se describen aquí producen datos sin procesar que se deben ensamblar en secuencias más largas, como los genomas completos ( ensamblaje de secuencias ). Hay muchos desafíos computacionales para lograr esto, como la evaluación de los datos de secuencia en bruto que se realiza mediante programas y algoritmos como Phred y Phrap . Otros desafíos tienen que lidiar con secuencias repetitivas que a menudo impiden el ensamblaje completo del genoma porque ocurren en muchos lugares del genoma. Como consecuencia, muchas secuencias pueden no ser asignadas a cromosomas particulares . La producción de datos de secuencia en bruto es solo el comienzo de su análisis bioinformático detallado. [131]Sin embargo, se desarrollaron nuevos métodos para secuenciar y corregir errores de secuenciación. [132]
Leer recorte [ editar ]
A veces, las lecturas en bruto producidas por el secuenciador son correctas y precisas solo en una fracción de su longitud. El uso de la lectura completa puede introducir artefactos en los análisis posteriores como el ensamblaje del genoma, la llamada a snp o la estimación de la expresión génica. Se han introducido dos clases de programas de recorte, basados en las clases de algoritmos basados en ventanas o en la suma de ejecución. [133]Esta es una lista parcial de los algoritmos de recorte actualmente disponibles, especificando la clase de algoritmo a la que pertenecen:
| Nombre del algoritmo | Tipo de algoritmo | Enlazar |
|---|---|---|
| Cutadapt [134] | Suma corriente | Cutadapt |
| ConDeTri [135] | Basado en la ventana | ConDeTri |
| ERNE-FILTRO [136] | Suma corriente | ERNE-FILTRO |
| Recortadora de calidad FASTX | Basado en la ventana | Recortadora de calidad FASTX |
| PRINSEQ [137] | Basado en la ventana | PRINSEQ |
| Trimomático [138] | Basado en la ventana | Trimomático |
| SolexaQA [139] | Basado en la ventana | SolexaQA |
| SolexaQA-BWA | Suma corriente | SolexaQA-BWA |
| Hoz | Basado en la ventana | Hoz |
Cuestiones éticas [ editar ]
![[icono]](https://en.wikipedia.org/wiki/File:Wiki_letter_w_cropped.svg){kind=small}
La genética humana se ha incluido en el campo de la bioética desde principios de la década de 1970 [140] y el crecimiento en el uso de la secuenciación de ADN (en particular la secuenciación de alto rendimiento) ha introducido una serie de problemas éticos. Un tema clave es la propiedad del ADN de un individuo y los datos producidos cuando se secuencia el ADN. [141] Con respecto a la molécula de ADN en sí, el caso legal principal sobre este tema, Moore v. Regentes de la Universidad de California (1990) dictaminó que los individuos no tienen derechos de propiedad sobre las células descartadas o cualquier beneficio obtenido al usar estas células (por ejemplo, como una línea celular patentada). Sin embargo, las personas tienen derecho a un consentimiento informado con respecto a la extracción y el uso de células. Con respecto a los datos producidos a través de la secuenciación del ADN, Moore no le otorga al individuo ningún derecho sobre la información derivada de su ADN. [141]
A medida que la secuenciación del ADN se generaliza, el almacenamiento, la seguridad y el intercambio de datos genómicos también se han vuelto más importantes. [141] [142] Por ejemplo, una preocupación es que las aseguradoras pueden usar los datos genómicos de un individuo para modificar su cotización, dependiendo de la salud futura percibida del individuo en función de su ADN. [142] [143] En mayo de 2008, se firmó la Ley de no discriminación de información genética (GINA) en los Estados Unidos, que prohíbe la discriminación sobre la base de información genética con respecto al seguro de salud y el empleo. [144] [145] En 2012, la Comisión Presidencial de Estados Unidos para el Estudio de Asuntos Bioéticosinformaron que la legislación de privacidad existente para los datos de secuenciación de ADN como GINA y la Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro de Salud eran insuficientes, destacando que los datos de secuenciación de todo el genoma eran particularmente sensibles, ya que podrían utilizarse para identificar no solo a la persona de la que se obtuvieron los datos. Creados, pero también sus familiares. [146] [147]
Los problemas éticos también se han planteado por el uso cada vez mayor de la detección de variaciones genéticas, tanto en recién nacidos como en adultos por parte de compañías como 23andMe . [148] [149] Se ha afirmado que la detección de variaciones genéticas puede ser dañina, lo que aumenta la ansiedad en las personas que tienen un mayor riesgo de enfermedad. [150] Por ejemplo, en un caso señalado en Time , los médicos que examinaron a un bebé enfermo para detectar variantes genéticas optaron por no informar a los padres de una variante no relacionada relacionada con la demencia debido al daño que causaría a los padres. [151] Sin embargo, un estudio de 2011 en The New England Journal of Medicineha demostrado que las personas sometidas a perfiles de riesgo de enfermedad no mostraron niveles elevados de ansiedad.
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