C-ADN también conocida como forma C de ADN . Es una de las muchas posibles estructuras de doble hélice del ADN . Esta forma de ADN se puede observar en algunas condiciones, como la humedad relativamente baja y la presencia de ciertos iones , como Li + o Mg 2+ .
Investigaciones recientes sugieren que tanto el C-ADN como el B-ADN consisten en dos conformaciones denucleótidos distintas , BI y B-II. La relación de conformación B-II en C-ADN es más del 40%. Sin embargo, la proporción de la conformación B-II en el B-ADN es solo de aproximadamente el 10%. Tiene 9.33 pb / turno. Esta forma de ADN no es muy estable y no es muy común. Tiene la mano derecha helice.
secuenciación del ADN en fase sólida se describió en 1989 basándose en la unión del ADN biotinilado a las perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina y la elución de una cadena de ADN de forma selectiva utilizando álcali [1] . El método permitió aplicaciones robóticas adecuadas para la secuenciación clínica, pero el manejo magnético también ha encontrado un uso frecuente en muchas aplicaciones moleculares, incluido el manejo de muestras para diagnósticos de ADN [2] . El uso de métodos de fase sólida para el manejo de ADN ahora se usa con frecuencia como parte integral de muchos de los métodos de secuenciación de ADN de la próxima generación , así como de numerosas aplicaciones de diagnóstico molecular .
2 La codificación básica , también denominada SOLiD ( secuenciación por ligamiento y detección de oligonucleótidos ), es una tecnología de secuenciación de última generación desarrollada por Applied Biosystems y está disponible comercialmente desde 2008. Estas tecnologías generan cientos de miles de pequeñas secuencias de lectura a la vez. Ejemplos bien conocidos de tales métodos de secuenciación de ADNincluyen 454 pirosecuenciaciones(introducido en 2005), el sistema Solexa (introducido en 2006) y el sistema SOLiD (introducido en 2007). Estos métodos han reducido el costo de $ 0.01 / base en 2004 a casi $ 0.0001 / base en 2006 y han aumentado la capacidad de secuenciación de 1,000,000 bases / máquina / día en 2004 a más de 100,000,000 bases / máquina / día en 2006.
La codificación de 2 bases se basa en la secuenciación de la ligadura en lugar de la secuenciación por síntesis. [1] Sin embargo, en lugar de utilizar sondas 9-mer marcadas con fluorescencia que distinguen solo 6 bases, la codificación de 2-bases se aprovecha de las sondas 8-mer marcadas con fluorescencia que distinguen las dos 3 bases principales, pero se pueden completar de manera similar al método de Macevicz , por lo tanto, se pueden obtener lecturas superiores a 6 pb (25-50 pb publicado, [2] 50 pb en NCBI en febrero de 2008). La codificación de 2 bases permite leer cada base dos veces sin realizar dos veces el trabajo.
SOLiD (secuenciación por ligación y detección de oligonucleótidos) es una tecnología de secuenciación de ADN de próxima generación desarrollada por Life Technologies y está disponible comercialmente desde 2006. Esta tecnología de próxima generación genera cientos de millones a miles de millones de lecturas de secuencias pequeñas a la vez.
Este método no debe confundirse con la "secuenciación por síntesis", un principio utilizado por la pirosecuenciación Roche-454 (introducida en 2005, generando millones de lecturas de 200-400 pb en 2009), y el sistema Solexa (ahora propiedad de Illumina) (introducido en 2006, generando cientos de millones de lecturas de 50-100 bp en 2009)
Estos métodos han reducido el costo de $ 0.01 / base en 2004 a casi $ 0.0001 / base en 2006 y han aumentado la capacidad de secuenciación de 1,000,000 bases / máquina / día en 2004 a más de 5,000,000,000 bases / máquina / día en 2009. Hay más de 30 publicaciones que describen su uso primero para el posicionamiento de nucleosomas de Valouev et al., [1] RNA-Seq de perfil transcripcional o sensible a la hebra con Cloonan et al., [2]perfil transcripcional de células individuales con Tang et al. [3] y, en última instancia, la resecuenciación humana con McKernan et al. [4]
Se ha informado que el método utilizado por esta máquina (secuenciación por ligación) tiene algún problema en la secuenciación de secuencias palindrómicas.
Química [ editar ]
Se prepara una biblioteca de fragmentos de ADN a partir de la muestra que se va a secuenciar, y se usa para preparar poblaciones de cuentas clonales. Es decir, solo una especie de fragmento estará presente en la superficie de cada cordón magnético. Los fragmentos unidos a las perlas magnéticas tendrán una secuencia de adaptador P1 universal unida de modo que la secuencia de inicio de cada fragmento sea tanto conocida como idéntica. La PCR de emulsión se realiza en microrreactores que contienen todos los reactivos necesarios para la PCR. Los productos de la PCR resultantes unidos a las perlas se unen covalentemente a un portaobjetos de vidrio.
Los cebadores se hibridan con la secuencia del adaptador P1 dentro de la plantilla de la biblioteca. Un conjunto de cuatro sondas di-base marcadas con fluorescencia compiten por la ligadura al cebador de secuenciación. La especificidad de la sonda di-base se logra interrogando a cada 1ra y 2da base en cada reacción de ligadura. Se realizan múltiples ciclos de ligadura, detección y escisión con el número de ciclos que determinan la longitud de lectura final. Después de una serie de ciclos de ligadura, el producto de extensión se elimina y la plantilla se reinicia con un cebador complementario a la posición n-1 para una segunda ronda de ciclos de ligadura.
Se completan cinco rondas de reinicio del cebador para cada etiqueta de secuencia. A través del proceso de reinicio del cebador, cada base es interrogada en dos reacciones de ligadura independientes por dos cebadores diferentes. Por ejemplo, la base en la posición de lectura 5 se analiza con el cebador número 2 en el ciclo de ligación 2 y con el cebador número 3 en el ciclo de ligación 1.
Rendimiento y precisión [ editar ]
Según ABI, la plataforma SOLiD 3plus produce 60 gigabases de datos de ADN utilizables por ejecución. Debido al sistema de codificación de dos bases, la tecnología incorpora una verificación de precisión inherente y ofrece una precisión del 99.94%. La química de los sistemas también significa que los homopolímeros no lo obstaculizan a diferencia del sistema Roche 454 FLX y que las regiones de repetición de homopolímeros tan grandes y difíciles ya no son un problema de secuencia.
Aplicaciones [ editar ]
Naturalmente, la tecnología se utilizará para secuenciar el ADN, pero debido a la alta naturaleza paralela de todas las tecnologías de próxima generación, también tienen aplicaciones en transcriptómica y epigenómica .
Microarrays fue una vez el pilar de la transcriptómica en los últimos diez años y, posteriormente, la tecnología basada en matrices se ha extendido a otras áreas. Sin embargo, están limitados en que solo se puede obtener información para las sondas que están en el chip. Solo se puede obtener información para los organismos para los que hay chips disponibles, y vienen con todos los problemas de hibridación de grandes números de moléculas (diferentes temperaturas de hibridación). La transcriptómica RNA-Seq mediante la secuenciación de la siguiente generación significará que estas barreras ya no serán verdaderas. El transcriptoma completo de cualquier organismo podría potencialmente secuenciarse en una ejecución (para genomas bacterianos muy pequeños) y no solo estaría disponible la identificación de cada transcripción sino que también es posible realizar un perfil de expresión, ya que también se pueden lograr lecturas cuantitativas.
La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método para determinar los sitios de unión al factor de transcripción y las interacciones ADN-proteína. En el pasado, se ha combinado con la tecnología de matriz (chip ChIP) con cierto éxito. La secuenciación de próxima generación también se puede aplicar en esta área. La inmunoprecipitación de metilación (MeDIP) también se puede realizar y también en arreglos.
La capacidad de aprender más sobre la metilación y los sitios de unión a TF a gran escala del genoma es un recurso valioso y podría enseñarnos mucho sobre la enfermedad y la biología molecular en general.
La PCR asimétrica es una variación de la PCR utilizada para amplificar preferentemente una cadena del ADNoriginal más que la otra. [1] La técnica tiene aplicaciones en algunos tipos de secuenciación y sondeo de hibridación donde se requiere tener solo una de las dos cadenas complementarias . [2]
Metodología [ editar ]
La PCR asimétrica se diferencia de la PCR regular por la cantidad excesiva de cebadores para una cadena elegida. Debido a la lenta (aritmética) amplificación más adelante en la reacción (después de que se haya agotado el cebador limitante) se requieren ciclos adicionales de PCR. [3]
Una modificación en este proceso, conocida como PCR Lineal-Después-Exponencial (LATE-PCR) , utiliza un cebador limitante con una temperatura de fusión más alta que el cebador en exceso para mantener la eficiencia de la reacción, ya que la concentración del cebador limitante disminuye la reacción media. [4]
Aplicaciones [ editar ]
La PCR asimétrica se puede usar para formar ADN monocatenario a partir de ADN bicatenario, que luego se usa para la secuenciación de ADN en el método de mutagénesis . [ cita requerida ] El ADN monocatenario también es importante para la generación de aptámeros .
BFAST es una herramienta de alineamiento de secuencia de ADN universal desarrollada en UCLA por Nils Homer. [1]
El servidor web BFAST se puede usar para alinear lecturas cortas con secuencias de referencia tanto en el espacio de nucleótidos como en el espacio de color ABI SOLiD .
Las utilidades incluyen la alineación BFAST, la conversión entre nucleótidos y el espacio de color, el cálculo del poder a priori de las alineaciones, así como una utilidad para realizar la alineación de Smith Waterman .
BFAST tiene un compromiso explícito de tiempo y precisión con una estimación de precisión previa, respaldada por la indexación de las secuencias de referencia. La herramienta puede manejar lecturas cortas, inserciones de ADN , eliminaciones , SNP y errores de color (lecturas de espacio de color ABI SOLiD).
La curva de Carlson es un término para describir la tasa de secuenciación del ADN o el costo por base secuenciada en función del tiempo. [1] Es el equivalente biotecnológico de la ley de Moore . Carlson predijo que el tiempo de duplicación de las tecnologías de secuenciaciónde ADN (medido por el costo y el rendimiento) sería al menos tan rápido como la ley de Moore. [2]
Historia [ editar ]
Las curvas de Carlson ilustran las reducciones rápidas (en algunos casos superiores al crecimiento exponencial ) en el costo y los aumentos en el rendimiento de una variedad de tecnologías, incluida la secuenciación de ADN , la síntesis de ADN y una gama de herramientas físicas y computacionales utilizadas en la producción de proteínas y en la determinación de proteínas. estructuras .
Secuenciación de la próxima generación [ editar ]
La Ley de Moore comenzó a ser profundamente superada en enero de 2008 cuando los centros pasaron de la secuenciación de Sanger a las nuevas tecnologías de secuenciación de ADN: [4] secuenciación 454 con longitud de lectura promedio = 300-400 bases (10 veces)secuenciación de Illumina y SOLiD con lectura promedio longitud = 50-100 bases (30 veces).
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