Biología celular

técnicas aplicadas
Microscopia de inmunofluorescencia.

Microscopio de fluorescencia

Este microscopio hace uso de la fluorescencia y se convierte en una herramienta de inestimable valor para la investigación científica, ya que permite alcanzar altos niveles de sensibilidad y resolución microscópica, permitiendo una apreciación diferente de la información que se puede obtener de los especímenes y que generalmente pasa desapercibida.

La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente en el año 1935 por Alexander Jablonski (107). Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de una mayor longitud de onda (de un determinado color, verde, rojo, amarillo) (fig. 6-21). Es un fenómeno de luminiscencia de vida corta, emitida simultáneamente con la excitación.

Figura 6-21.-Imagen que muestra el principio de la fluorescencia. Arriba se observa el rayo incidente (color azul claro) de una determinada longitud de onda, el cual es absorbido por las partículas fluorescentes (esferas naranja) que responden emitiendo otra luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de onda mayor que la de la luz incidente. Tomado de Fluorescencia y fluorocromos (108).

Los términos de fluorocromo y fluoróforo definen los siguientes conceptos:
• Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes.

• Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de fluorescencia.

Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y de emisión específico que depende de la composición y estructura de la molécula fluorescente (tabla 6-1) (fig.6-22).

Fluorocromo	Longitud de onda de absorción (nm)	Longitud de onda de emisión (nm)
Cascade blue	374-403	422-430
Fluoresceína (FITC)	494	520
Rodamina (TRITC)	540	570
Naranja de acridina	460-502	526-650
Yoduro de propidio	536	617

Tabla 6-1.-Algunos de los principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia y sus respectivos espectros de absorción y emisión en valores aproximados. Modificado de Costa J. 2004 (109).

Figura 6-22.-Espectro de excitación y de emisión de dos fluorocromos de uso común. La línea negra continua representa el espectro de excitación, la línea negra punteada muestra el espectro de emisión. La fluoresceína al ser excitada por una luz de longitud de onda de aproximadamente 495 nm (azul) emite una luz de color verde cuya longitud de onda esta alrededor de 519 nm. Modificado de Excitation and Emission Spectra of Fluorescent Dyes. Leica Microsystems (110).

También existen fluorocromos intracelulares naturales, tales como nucleótidos de nicotina reducidos (NADH, NADPH), nucleótidos de flavina oxidados, clorofilas, proteínas fluorescentes (Green Fluorescent Protein GFP) y esto debe ser tomado en cuanta al realizar esta técnica con marcadores fluorescentes.

La microscopía de fluorescencia es muy útil porque la molécula fluorescente, aún cuando sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite. Los fluorocromos actúan como fuentes de luz de un color determinado que pueden ser localizadas en áreas específicas de la muestra que se estudia. El marcaje selectivo de moléculas y otros compuestos celulares se realiza mediante la técnica de inmunofluorescencia (21).

6.5.1.-Requerimientos para el microscopio de fluorescencia

• Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el espectro específico de cada fluorocromo. Hay que tomar en cuenta que la fluorescencia es pasajera y la iluminación produce un efecto de fotoblanqueo en el fluorocromo; además, las células vivas pueden ser dañadas por la intensa radiación. La luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lámparas de mercurio a alta presión que funcionan de un modo diferente a las lámparas de filamentos incandescentes. También se utiliza luz ultravioleta y rayos laser. Muchos modelos funcionan con epi-iluminación (13).

• Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no deseadas. Una vez filtrada, la luz incide sobre el espécimen por reflexión de un espejo dicroico (epi-iluminación) y es nuevamente filtrada para poder ser observada (fig. 6-23).

• Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numérica.

Figura 6-23.-Esquema básico de la iluminación en el microscopio de fluorescencia. La luz blanca emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo, solo la luz azul. El espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azul) pero deja pasar otras. Filtra la luz azul que excita al fluorocromo (fluoresceína) pero por el contrario, deja pasar la luz verde emitida. Tomada de wikipedia.org (111).

Los filtros empleados son útiles porque por ejemplo, cuando se emplea la fluoresceína, el espécimen se ilumina con una luz azul monocromática pura y filtrada. Para visualizarlo se emplea otro filtro el cual es completamente opaco a la luz azul pero deja pasar la luz verde (o amarilla y roja emitidas por otros fluorocromos). Las estructuras celulares marcadas mediante inmunofluorescencia aparecen iluminadas de verde contrastando con un fondo negro (fig. 6-24).

Figura 6-24.-Micrografias de células en división, tomadas con un microscopio de fluorescencia. Se emplearon tres fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas, GFP (proteína verde fluorescente intracelular que emite luz verde) y rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos. Cada fluorocromo amerita el uso de filtros específicos, dependiendo de la longitud de onda necesaria para su excitación, señalada arriba y a la izquierda en cada imagen y expresada en nm. Tomada de wikipedia.org (111).

6.5.2.-Aplicaciones del microscopio de fluorescencia

Son numerosas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, notablemente en biología y medicina (112, 113, 114):

• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.

• Estudio de células normales y patológicas.

• Estudios inmunológicos.

• Mineralogía.

Microscopia de inmunofluorescencia.

En 1941  Coons intentó conjugar  los anticuerpos con colorantes fluorescentes y en 1942 publicó la primera aplicación de esta técnica inmunológica.
  La microscopia de inmunofluorescencia es una técnica inmunohistoquímica que consiste en conjugar colorantes fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína, rodamina B de lisamina o ácido 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfónico) con anticuerpos o antígenos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia (1,2) (ver figura 1b).
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorophase.html
 

DESCRIPCION DEL MICROSCOPIO DE INMUNOFLUORESCENCIA 

        Consta de una fuente de luz (lámpara de mercurio o halógena) la cual debe emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta , el microscopio y un sistema de filtros, el de excitación o selección de luz ubicado entre la fuente de luz y el preparado, tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente. Es segundo filtro es el de calor y está ubicado entre la fuente de luz y el filtro de excitación en los microscopios de luz transmitida y entre la fuente de luz y el espejo dicrómico en los microscopios de luz incidente. El tercer tipo de filtro es de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico (3).
FUNCIONAMIENTO
        La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación.
Clases de técnicas utilizadas para la preparación de las muestras
DIRECTA : Es una técnica que consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante reacción directa con un anticuerpo específico marcado con colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a través de la inoculación del microorganismo productor del antígeno en un modelo animal (2,3,4,5,6).
INDIRECTA : Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo (4).
        El proceso consta de dos etapas: en la primera se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que constituyen el substrato conocido específico (células que contiene virus, T. gondii, T. pallidum, etc.) sobre él se coloca el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos específicos, si la reacción es positiva se dará formación de complejo antígeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado (7).
        En la segunda etapa se debe obtener una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionará con el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa. La anti-inmunoglobulina se obtiene así: de una mezcla de varios sueros de personas normales, se precipitan las globulinas (anticuerpo),  están globulinas son inoculadas a un organismos (conejos, cabras), el organismo producirá antiglobulinas humanas que se marcan con fluoresceína o cualquier otro de los colorantes. Este anticuerpo marcado se unirá al anticuerpo humano no marcado de la primera etapa que en esta momento se puede considerar como un antígeno, dando reacción positiva de fluorescencia solamente si en la primera etapa se produjo unión entre el antígeno fija en la placa y el anticuerpo presente en el suero humano que estamos evaluando (4,7).
        La técnica indirecta tiene ventajas: la inmunofluorescencia es más brillante que la detección directa debido a que varias anti-inmunoglobulinas fluorescentes se pueden unir a cada una de las moléculas de Antígeno-anticuerpo presentes en la primera capa, además dado que el proceso de conjugación es largo, se ahorra tiempo cuando se estudian varios sueros para la determinación de anticuerpo ya que sólo es necesario prepara un único reactivo marcado : la anti-inmunoglobulina (4).
SANDWICH : Este es un procedimiento de doble capa diseñado para visualizar anticuerpos específicos. El nombre de la determinación deriva de la observación que el antígeno se ubica entre el anticuerpo presente en el sustrato de la célula y el agregado como segunda capa (4).
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA (1)
A. Métodos de conjugación : Es posible conjugar las proteínas en el suero completo o en fracciones de suero luego de concentrar los anticuerpos.
Se debe añadir al suero un amortiguador de carbonato-bicarbonato para mantener condiciones óptimas de pH (9.0), se agita en baño de hielo añadiendo fluorocromo en un período de 15 minutos, se debe permitir una agitación toda la noche ya que la conjugación es del orden del 100% en 24 horas.
B. Purificación del conjugado : Se logra mediante eliminación por diálisis de las sales amortiguadoras y los elementos utilizados como solventes del fluorocromo (acetona). Se utiliza extracción con carbón o filtración en columna de sephadex para eliminar las sustancias fluorescentes Que. no reaccionaron lo cual puede ocasionar tinción inespecífica.
C. Concentración del Anticuerpo : Se logra mediante tratamiento con sales de amonio saturado. El almacenamiento es el solución salina amortiguada con fosfato a pH 7.1.
D. Preparación de anticuerpos : Se obtienen mediante inmunización en animales, la globulina humana se aplica en 2 o 3 inyecciones a intervalos de 3-4 semanas, la respuesta de anticuerpos se mide mediante métodos serológicos y el suero se recoge 7-10 días luego de la última inyección.
E. Manejo de cortes y tejidos : Los frotis y cortes montados que no se estudien de inmediato se pueden proteger por sumersión en carbowax y almacenamiento a -20°C. Los cortes liofilizados protegidos con resina de poliester se pueden conservar varios meses en un desecador a 0°C sin que pierda sus antígenos.
        Es preferible trabajar con cortes fijados ya que.la tinción inmunofluorescente en cortes sin fijar se acompaña de difusión o pérdida del antígeno además se reduce la autoinmunofluorescencia tisular (vesículas y partículas).
        Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antígeno-anticuerpo, el más empleado es alcohol etílico al 95% entre 4-30°C, alcohol metílico, acetona o formol. Para bacterias es muy útil la fijación mediante calor. La inclusión en parafina de los tejidos es muy usado y puede lograr una localización más precisa y una tinción más viva que con cortes en congelación.
FLUOROCROMOS - Sustancias que emiten un fotón cuando son excitados por un fotón incidente.

        Se deben utilizar colorantes que formen uniones con las proteínas pero sin afectar los grupos de combinación específica del anticuerpo. La reacción de unión ocurre entre los grupos amino y carboxilo de la proteína y los grupos tiocianato o cloruro de sulfonilo de los colorantes. El fenómeno de fijación disminuye la fluorescencia de los fluorocromos de tal manera que los conjugados solo muestran de 15-30% de la fluorescencia del colorante libre.
        El pH afecta la fluorescencia y  por esta razón se debe trabajar a pH estable y adecuado dependiendo del colorante : fluoresceína (pH 8), rodamina (pH 7), DANS (pH 1.6-14) (1).
    El colorante fluorescente es una molécula que absorbe luz en una longitud de onda, lo que excita los electrones y los lleva a un nivel energético mayor y al volver a su nivel energético inicial emite luz en una segunda longitud de onda. El isocianato de fluoresceína y el DANS muestran una fluorescencia verde manzana bajo la luz ultravioleta y la rodamina anarajando brillante(1).
    Cuando el lapso de tiempo entre la absorcion de la luz activamente y la emision de la nueva luz es mayor de 1/10000 segundos el fenomeno se define como fosforescencia, pero cuando el fenomeno es menor de 1/10000 segundos se define comofluorescencia.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS
VENTAJAS 
- Se pueden obtener resultados rápidos.
-No es necesario realizar cultivos.
-Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto.
-Determina la identidad de un organismo muerto.
-Es sensible.Nota: La figura muestra un ejemplo de fagocitosis.

DESVENTAJAS
-Costos en reactivo y equipo
-Debe ser realizado por personal muy especializado.
-Los resultados no son 100% específicos (como toda técnica serológica).
APLICACIONES
    Esta técnica tiene múltiples aplicaciones en diagnóstico e investigación. Se ha utilizado en estudios bacteriológicos, virales, parasitológicos. Se ha utilizado en el estudio de la distribución intracelular de las moléculas.
A dividing cell showing the genetic material in chromosomes (blue) connected via INCEPs (pink) to the cell skeleton tubulin tracks (green).The tracks guide one set of genes to each daughter cell. Courtesy of Bill Earnshaw ICMB, University of Edinburgh